[發明專利]一種檢測利瑪原甲藻的方法

有效

• 申請號: 201210005132.4
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102433390A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 唐晨;董麗;何培民;饒濤;賈睿
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

1.一種檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)用CTAB改良法提取待測水樣中的瑪原甲藻的基因組DNA；

(2)用特異性引物和特異性探針，擴增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測方法，對照標準曲線，確定待測水樣中瑪原甲藻含量；

ITS基因序列的特異性引物為：上游cttggaatggcgcaacaagc，下游aaaccacaagacacgatgaaacg；

PKS基因序列的特異性引物為：上游atccccagcaacgattattaatgg，下游tgcgtgaaagcgaagagtcc；

ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列：

ccaaacctgccaccgttcctcgct；

PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列：

cggctcgctccaacgcttcccaac。

2.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟(2)中94～96℃條件下，預變性1.5～2.5min；循環溫度，94.5～95.5℃10sec、59.8～60.5℃30sec，35～40次循環。

3.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟(2)中PKS基因序列的TaqMan探針5’端使用報告染料FAM標記；ITS基因序列的TaqMan探針5’端使用報告染料HEX標記；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探針3’端用報告染料TAMRA標記。

4.權利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟(2)中標準曲線的測定構建方法包括以下步驟：

以對應不同濃度利瑪原甲藻的利瑪原甲藻基因組DNA為模板，分別加入相應的基因序列的特異性引物和TaqMan探針擴增。