[發明專利]基因重組VPAC2受體特異激動劑DBAYL及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210005129.2
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102558335A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 馬義;洪岸
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P3/10;A61P9/12;A61P7/02;A61P3/04;A61P9/00;A61P25/00;A61P13/12;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL及其制備方法，與其用于制備治療VPAC2型受體相關疾病的藥物，如：促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力，有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加β細胞數量和抑制β細胞凋亡及調節免疫系統功能等作用。

背景技術

垂體腺苷酸環化酶激活肽(PACAP)是1990年被發現由腦垂體分泌的具有重要生物學功能的神經多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP有兩種存在形式：PACAP38，由38個氨基酸組成；PACAP27，由PACAP38氮端的27個氨基酸組成。PACAP通過激活其特異的G蛋白偶聯受體，提高靶細胞cAMP等第二信使的濃度，從而發揮廣泛而重要的生物學功能。PACAP有三類G蛋白偶聯受體：PAC1、VPAC1和VPAC2；三類受體在生物體中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受體分布于胰島等組織，與能量代謝密切相關，從臨床觀點看，作為VPAC2型受體特異激動劑的特定PACAP衍生物可有效地降低血液葡萄糖水平，保護β-細胞功能及阻止疾病發展的潛力，且無低血糖癥風險，可用于糖尿病的任何病期，作為具有廣泛作用的神經多肽，對于二期和三期糖尿病患者具有優于其他藥物的綜合治療作用，為公認的治療Ⅱ型糖尿病的新型藥物。

PACAP與VPAC2受體作用主要與腺苷酸環化酶(AC)藕聯：通過cAMP信號傳導通路，激活AC，催化ATP轉化為cAMP，cAMP隨之激活其依賴性蛋白激酶A(PKA)，PKA可使細胞內多種蛋白質磷酸化，產生生理效應，尤其是在促進相關基因轉錄有重要作用。PACAP通過VPAC2受體介導的生物學功能主要有：神經遞質/調質、促進激素分泌，調節內分泌平衡；調節性腺功能和生殖細胞的產生；調節能量代謝平衡等。

研究表明，VPAC2型受體特異激動劑可有效促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加β細胞數量和抑制β細胞凋亡。但PACAP及其許多衍生物，如BAY55-9837等，在體內很快被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)降解；而且由于自身結構中含有影響其液體環境中穩定性的氨基酸組成，許多藥物肽在生物體內穩定性較差。因此，研發生理環境下新型高穩定性VPAC2受體特異激動劑是PACAP及其衍生多肽用于Ⅱ型糖尿病治療及臨床應用急待解決的問題，研發作為VPAC2型受體特異激動劑的高穩定性PACAP衍生多肽，具有重要的藥用價值。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有更高穩定性和更高生物活性的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL。

本發明的另一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法。該制備方法根據PACAP衍生多肽DBAYL的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設計DBAYL在原核表達系統的基因序列，采用基因工程技術，結合蛋白內含肽(intein)的可誘導剪切功能實現目的多肽DBAYL的高效制備；該制備方法生產效率高，生產成本低。

本發明的再一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其氨基酸序列如下所示：

MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY；

編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列為：

ATGCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAACAGCTGGCGGCGAAAAAATATCTGCAGAGCATTAAACAGAAACGTTAT；

所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，包括以下步驟：

(1)設計并合成DBAYL基因：

采用3條引物兩步法合成DBAYL基因：

引物F1：

5’-GGTGGTCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3’；

引物F2：

5’-CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’；

引物F3：