[發明專利]基因重組VPAC2受體特異激動劑DBAYL及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210005129.2
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102558335A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 馬義;洪岸
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P3/10;A61P9/12;A61P7/02;A61P3/04;A61P9/00;A61P25/00;A61P13/12;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于：編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.權利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)設計并合成DBAYL基因：

采用3條引物兩步法合成DBAYL基因：

引物F1：

5’-GGTGGTCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3’；

引物F2：

5’-CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’；

引物F3：

5’-CCACCAATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3’；

其中，GGTGGT或CCACCA為保護堿基，為NdeI酶切位點，為SapI酶切位點；

首先將引物F1和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以F1和F3為引物，PCR反應制得DBAYL基因；

(2)構建重組載體pKY-DBAYL：

用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pKYB和步驟(1)制得的DBAYL基因進行雙酶切，再將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質粒pKYB連接，得到重組載體pKY-DBAYL；

(3)制備表達工程菌pKY-DBAYL/ER2566：

用重組載體pKY-DBAYL轉化表達宿主菌大腸桿菌E?coli?Strain?ER2566，得到表達工程菌pKY-DBAYL/ER2566；

(4)表達和純化：

①誘導表達工程菌pKY-DBAYL/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；硫醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，從而產生穩定的水解產物；

③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL。

4.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件為94℃10min；降至58℃5min；72℃10min。

5.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的PCR反應的條件為：95℃5min；95℃1min、55℃1min、72℃1min，32個循環；72℃延伸10min。

6.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于：步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下：20mMTris-HCI，0.5M?NaCl，1mM?EDTA，50mMβ-巰基乙醇，pH?8.0；

步驟(4)②中所述反應的條件為25℃反應24小時；

步驟(4)②中所述洗脫幾丁質柱的溶液的組成如下：20mM?Tris-HCl，500mMNaCI，1mM?EDTA，pH?8.0。

7.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于：步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術純化目的多肽DBAYL的步驟如下：

A、流動相A為在體積百分比5％乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0.1％；流動相B為100％乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0.1％；流速1mL/min，25min線性梯度洗脫；

B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比0～60％，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm；并進行質譜鑒定。

8.權利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應用，其特征在于：所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL用于制備治療如下疾病的藥物：糖尿病及其并發癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經系統疾病、心臟及腎衰竭。