[發明專利]分枝桿菌最低抑菌濃度檢測系統的制備方法

無效

• 申請號: 201210005116.5
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102559844A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張舒林;孫戰強;余曉麗;張朝寶;王洪海
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 張澤純

技術領域

本發明涉及分枝桿菌的藥物最低抑菌濃度(MIC)檢測或抗菌藥物篩選領域，具體涉及一種分枝桿菌的藥物最低抑菌濃度(MIC)檢測系統的制備方法，所述檢測系統適用于分枝桿菌、放線菌、真菌、細胞等藥敏檢測檢測。

背景技術

迄今為止，結核病仍是全球范圍內最為常見的感染性疾病之一，盡管全球結核病總發病率已開始下降，但耐藥現象日益嚴重。世界衛生組織(WHO)數據表明2010年世界結核病患者880萬，死亡110萬。不完善的治療方案和管理措施已導致結核病耐藥率及耐藥程度逐漸增加，2010年至少有5％的新發病例或復發病例屬于耐多藥結核病(MDR-TB)。目前，中國仍是世界第二大結核病負擔國，2010年患病人數達90-120萬，2008年我國基線調查表明，涂陽肺結核患者中MDR-TB患病率為8.32％，廣泛耐藥結核病(XDR-TB)為0.68％。

結核病的病原體是抗酸分枝桿菌，主要是結核分枝桿菌復合群，其次為非結核分枝桿菌(NTM)。由于結核分枝桿菌耐藥的增加及NTM對一些常見抗結核藥物的天然耐受，使分枝桿菌MIC的檢測顯得尤為重要。分枝桿菌MIC值反應了細菌的耐藥程度，其準確而快速的檢測對臨床事實個體化治療、藥物劑量的優化以及抗結核新藥的篩選具有重要作用。

目前可用于結核分枝桿菌MIC值測定的方法按所使用的培養基類型分為兩大類：一是基于傳統固體培養基的表型檢測方法如：瓊脂稀釋法、紙片瓊脂擴散法、Etest法等；二是基于液體培養基中結核分枝桿菌的生長或其代謝反應為基礎的檢測方法具體有：BACTEC放射性檢測系統、分枝桿菌生長指示管MGIT、肉湯常量稀釋法、肉湯微量稀釋法(BMM)、硝酸還原法(NRA)、阿瑪爾藍(Alamar?blue)法、刃天青法、四唑鹽法等。由于固體培養基中藥敏檢測周期較長，藥物降解、吸附明顯，測定結果偏高，其運用受到一定的限制；而基于液體培養基檢測方法中的BACTEC放射性檢測系統雖然檢測周期較短，但常只檢測藥物的一個臨界濃度，且具有放射性污染。分枝桿菌生長指示管MGIT法解決了放射性污染問題，檢測速度快，敏感度和特異性較高，但也僅進行藥物一個濃度的檢測，而不是MIC檢測，此外其成本較高難以在發展中國家廣泛運用。肉湯常量稀釋法消耗培養基較多，成本較高。肉湯微量稀釋法(BMM)，雖然降低了培養基的使用量，但其靠肉眼觀察菌量進行判讀，容易誤讀，且靈敏度有限。液體培養中的幾種基于氧化還原指示劑的微量顯色法檢測周期相對較短，其測定結果與血藥濃度更有可比性，具有巨大的運用潛能。目前所使用的微量顯色法都是先將菌液培養一段時間后，打開培養板蓋子，加入顯示試劑，再進行短時間的培養顯色，這既操作復雜又增加了污染幾率，還容易引起生物安全問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有檢測方法的不足，提供一種適用于分枝桿菌藥物MIC檢測系統的制備方法，具有操作簡便、快捷、穩定性好、污染率低可用簡單設備或肉眼判讀結果的優點。為分枝桿菌藥物MIC檢測、藥物篩選等提供一種簡單、快速、廉價的檢測系統。

為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現：

分枝桿菌最低抑菌濃度檢測系統的制備方法，包括以下步驟：將配制好的50-200微升、濃度為0.01-400微克/毫升的含藥液體培養基與5-100微升1×10³-1×10⁸個/毫升的分枝桿菌菌液、5-50微升顯色劑混合，在30-40攝氏度下恒溫共培養3-14天后，進行顯色檢測，并根據顯色檢測結果，判定藥物最低抑菌濃度，其中在混合后，所述顯色劑的終濃度為0.08-10毫摩爾/升。

在本發明的一實施方式中，所述方法還包括將5-50微升的中間電子受體與所述含藥液體培養基、分枝桿菌菌液、顯色劑混合，其中在混合后，所述中間電子受體的終濃度為10-200微摩爾/升。

在本發明的一實施方式中，所述分枝桿菌主要為結核分枝桿菌復合群，其次為非結核分枝桿菌(NTM)，還可以為放線菌、真菌或細胞。

在本發明的一實施方式中，所述分枝桿菌菌液的制備為采用麥式比濁法或吸光度法獲得一定濃度的菌液，按一定倍數進行稀釋或不稀釋后備用。

在本發明的一實施方式中，所述含藥液體培養基的配制是按照倍比稀釋法用液體培養基稀釋藥物。

在本發明的一實施方式中，在適當的培養載體中配制所述含藥液體培養基，所述培養載體是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的離心管或不低于5毫升的試管。