[發明專利]總膽汁酸的定量測定及測定試劑盒

無效

• 申請號: 201210005093.8
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102539791A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李清華;宋高峰
• 申請（專利權）人: 寧波天康生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/96
• 分類號: G01N33/96;G01N21/31
• 代理公司: 余姚德盛專利代理事務所(普通合伙) 33239
• 代理人: 周積德

技術領域

本發明涉及總膽汁酸(TBA)的定量測定方法、試劑及試劑盒。

背景技術

膽汁酸是在肝臟從膽固醇生成的24-碳類固醇化合物，在人體液中的膽汁酸主要有五種形式：膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、和熊脫氧膽酸。這些膽酸合起來稱為總膽汁酸(TBA)。血清膽汁酸水平是反映肝實質損傷的一個重要指標。餐后TBA測定對檢出輕度肝臟病變的靈敏度優于所有其他肝功能試驗。對檢測酒精或工業化學品引起的肝細胞損傷的靈敏度優于其它肝功能試驗。

大多數膽汁酸測定方法在測定前需有分離提取步驟，這是因為膽汁酸的不溶性、多型性和以多種結合狀態存在于體液中等因素。常用的分離方法包括采用有機溶劑和中性樹脂提取，陰離子交換層析方法等，但這些方法都有較多的缺陷，如不易將所有各種不同形式的膽汁酸同時全部提取與分離，實驗費時，操作繁瑣，而且無法進行自動化測定因而不適合在臨床實驗室應用。而且由于一般情況下血清中的膽汁酸含量較低，上述方法重復性與準確性也往往達不到要求。

膽汁酸作為從膽固醇轉化形成的類固醇，其分子上3α-羥基對3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)的酶催化作用比較敏感，膽汁酸C3上α位的羥基在3α-HSD的作用下脫氫形成羰基，此酶促反應的輔酶是氧化型輔酶I(NAD⁺)，反應后NAD⁺作為受氫體轉化成還原型輔酶I(NADH)。根據這一酶法反應的原理發展出幾種可以適合臨床實驗室進行膽汁酸分析的方法，其一是直接檢測NAD⁺向NADH的轉變，但因血清樣品中膽汁酸的含量較低而不易準確測定；其二是在上述單一酶促反應基礎上增加另一電子受體如刃天青，刃天青接受NADH的遞氫作用后可被激發出熒光，但此法需要特殊的熒光分光光度計且不能進行自動分析；其三是在上述單一酶促反應基礎上增加另一個酶(黃遞酶)和另一個受氫體(硝基四氮唑藍NBT)，NBT受氫后生成有色物質，可以用比色法測定，但也存在檢測靈敏度與準確性的問題，且因需要用磷酸或鹽酸中止反應，所以也難以自動化分析；雖然后來對上述第三種方法作了改進后也發展出可以進行自動分析的方法，但由于血清中總膽汁酸(TBA)的濃度較低，而且血清中存在的干擾物質對測定結果的影響相對較大，例如一個主要的干擾因素是血清中存在的乳酸脫氫酶(LDH)，由于LDH催化的反應生成的NADH往往比TBA生成的量要大得多，對測定結果有明顯的正干擾，導致測定結果偏高。血清樣品中存在的其他脫氫酶和還原性物質也會產生正干擾，同樣導致測定結果偏高。

后來發展了測定TBA的第五代循環酶法。此法的反應體系中引入輔酶I的一種硫代衍生物，也有氧化型和還原型，即氧化型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)和還原型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。所謂循環酶法，其反應過程的原理如下：

膽汁酸被3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)氧化，生成3-酮類固醇，脫下的氫被Thio-NAD接受，使Thio-NAD轉化為Thio-NADH；同時在反應體系中還存在NADH時，3α-HSD又催化逆向反應，使正反應生成的3-酮類固醇又氧化成為膽汁酸，完成一個循環。經如此反復循環的酶反應，Thio-NADH的生成量不斷增大，在一定時間內，酶循環產生的β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(Thio-NADH)量與樣品中膽汁酸濃度成正比。Thio-NADH在395nm～415nm波長處有光吸收峰，可在自動生化分析儀器內連續監測410nm的吸光度變化，求得膽汁酸的濃度。

目前，以第五代酶循環法測定TBA的市售試劑多為進口產品，價格偏高。經相關專利的檢索，未檢索到第五代酶循環法測定TBA的試劑(盒)的專利。因此，研制發明適用于自動分析的以第五代酶循環法測定TBA的方法，和性能更為優良，能有效抗干擾能力，價格更為低廉的試劑是值得所屬領域技術人員努力的目標。

發明內容

在對酶循環法測定TBA的方法進行多年研究以及反復實驗后，在以下幾方面有了重大突破：

試劑中Thio-NAD、NADH來源的選擇非常重要，對循環酶反應的效率、速度、和穩定性有直接影響。

1、試劑中Thio-NAD、NADH的濃度與相對比例的選擇直接影響酶反應的速度，是準確測定樣品TBA濃度的一個關鍵因素。

2、為使血清中各種膽汁酸(包括一級、二級和三級膽汁酸)都能通過循環酶反應而測定，在試劑中除了加入3α-羥類固醇脫氫酶之外，還加入了7α-羥類固醇脫氫酶。