[發明專利]家蠶質型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201210004704.7
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102559929A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 吳萍;郭錫杰;李龍;陳濤
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

一種家蠶質型多角體病毒(BmCPV)熒光定量PCR檢測方法，屬生物技術領域。?

背景技術

家蠶質型多角體病毒(Bombyx?mori?cytoplasmic?polyhedrosis?virus，BmCPV)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，是危害養蠶業的主要病原物之一，給生產上造成了巨大經濟損失。BmCPV病毒粒子直徑約為50-65nm，形狀呈正二十面體，具有獨特的單層衣殼結構。基因組由10節段雙鏈RNA分子組成，目前把質型多角體病毒按照電泳遷移率的不同分成14個電泳型，BmCPV屬I型。其宿主域主要是鱗翅目，雙翅目，膜翅目和鞘翅目等昆蟲。BmCPV專一性感染家蠶中腸上皮細胞，感染了BmCPV的家蠶中腸上皮細胞的主要細胞器均發生顯著病變。家蠶表現為發育不良、體形瘦弱、行動呆滯。隨著病程的推進，在中腸后部可看到白色的褶皺，這是家蠶質型多角體病的典型病癥之一。中腸乳白色的病變是家蠶質型多角體病肉眼診斷的重要依據之一。?

目前對家蠶質型多角體病的防治尚未取得突破性進展，生產上主要以預防為主。家蠶病毒病的診斷技術相對落后，主要通過對典型癥狀的肉眼判斷為主。雖然，也有學者嘗試利用其它諸如血清學方法、酶聯抗體-ELISA法、膠乳凝集反應和單克隆抗體法用于家蠶病毒病的診斷，但這些檢測方法有的準確性低、有的無法定量，有的操作煩瑣等，均沒有形成體系化、穩定化的檢測方法，很難在實際診斷中推廣應用。經對現有發明專利檢索發現，劉吉平等(專利號：CN102154522A，2011年)采用常規PCR方法檢測BmCPV。常規PCR方法擴增后需電泳檢測，易造成PCR產物污染及環境污染，不能定量，且不適合高通量檢測。熒光定量PCR將常規PCR和熒光檢測相結合，儀器自動分析，高通量，無后續處理，具有高靈敏性、高特異性、重現性好，且可以對樣品中的病毒含量進行準確定量，已成為病毒檢測的重要方法。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種家蠶質型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法。本發明檢測靈敏度可達10¹個數量級拷貝的病毒分子，具有靈敏性高、穩定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點。?

本發明通過以下技術方案予以實現，步驟如下：?

步驟一，以家蠶質型多角體蛋白基因的保守序列為靶目標，利用Primer?Premier?5.0軟件設計特異性引物，擴增目的基因片斷(SEQ?ID?No：1)。所述特異性引物為：?

正向引物：5′ATACAAGGTTGGCATTTCAGA?3’，?

反向引物：5′ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT?3’。?

步驟二，構建含目的基因片斷的定量標準質粒，所用載體為pGEM-T?Easy；?

步驟三，提取樣品RNA，反轉錄合成cDNA；?

步驟四，實時熒光定量PCR擴增及標準曲線的建立。PCR反應體系為：95℃預變性3min；95℃15s，60℃1min，共40個循環。?

本發明的有益效果為：與RT-PCR相比，本發明的方法無需擴增后電泳分析，避免了PCR產物污染及制膠過程中的健康損害；本發明的方法具有靈敏性高、穩定性強、特異性好及可以準確定量等特點；本發明可同時進行大批量樣品的檢測，具有高通量性；本發明方法檢測范圍廣，在10¹-10⁷拷貝范圍內具有良好的線性關系，檢測范圍可達7個數量級。?

附圖說明

圖1家蠶質型多角體病毒絕對定量的標準曲線圖。?

圖2家蠶質型多角體病毒熒光定量PCR擴增曲線圖。?

具體實施方式

下面結合具體實例進一步說明本發明。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法或按照制造廠商所建議的條件；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。?

實施例?

步驟一，設計特異性引物?

從基因數據庫中檢索獲得家蠶質型多角體蛋白基因序列(登錄號為AB003361)，利用Primer?Premier?5.0軟件設計得到一條特異性引物，目的擴增片段為118bp(SEQ?ID?NO：1)。設計的引物序列為：?

正向引物：5′ATACAAGGTTGGCATTTCAGA?3’，(SEQ?ID?NO：2)

反向引物：5′ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT?3’。(SEQ?ID?NO：3)