[發明專利]一種提高傳代細胞系凍存細胞復蘇率的復蘇方法

無效

• 申請號: 201210004302.7
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102559573A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉長輝;王敏;邊程
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;福州大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞生物學技術領域，涉及體外傳代細胞培養技術，更具體涉及一種提高傳代細胞系凍存細胞復蘇率的復蘇方法。

背景技術

在生物學技術飛速發展的當今，人們在細胞生物學及其相關學科的研究中，越來越多的運用細胞培養增殖技術，將有研究意義或有應用前景的細胞采用低溫度進行長期保存數年，數十年甚至百年，一旦需要，可隨時對所保存的細胞進行復蘇，恢復其完整的形態結構與生物學特性，供生命科學研究實驗。

復蘇率是指：在長期冷凍保存狀態下的細胞，經過復蘇過程，恢復其活性與生物學特性的細胞數量占凍存細胞總數的百分比。

影響細胞復蘇率的因素有三部分：降溫冷凍過程、低溫下保存過程及升溫復蘇過程。

凍存細胞復蘇后16-24小時，在普通光學顯微鏡下觀察：當復蘇率小于40％時，見活細胞較少而且形態不規則，生長繁殖速度緩慢，甚至停止生長死亡，導致細胞保存失敗；當復蘇率大于40％且小于70％時，顯示部分成活細胞，細胞大小不均勻，生長繁殖速度慢，培養5-7天才能生長成單層細胞；當復蘇率大于80％時，顯示成活細胞較多，細胞形態正常，生長繁殖速度快，培養2-3天就能生長成單層細胞。

綜上所述，升溫復蘇過程，是直接影響人工培養細胞增殖是否成功和順利進行的一個關鍵技術。復蘇率的高低是直接影響細胞生長質量與增殖周期的重要因素。所以復蘇的方法對復蘇率有重要和直接的影響作用。

數十年來，大量國內外生物細胞學技術相關書籍，介紹常規的復蘇方法如下操作：

1、從液氮中取出細胞凍存管，置37℃水浴，180-300秒融化，加入適配營養液，800轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入適配生長液適量，靜止37℃培養；

2、16-24小時鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見約60-70％的細胞貼壁生長，細胞形態邊緣不光滑，有凹凸，大小不均勻，折光性差，培養液中有大量懸浮圓縮的無活力細胞；

3、更換適配生長液，繼續培養至48小時；

4、鏡下觀察細胞未生長成單層，60-80％融合，繼續培養至72-96小時，細胞完全融合，按比例傳代培養；

5、完成細胞復蘇生長繁殖周期。

以上廣泛使用的復蘇溫度37℃，再者由于聚丙烯凍存管在實際中的大量廣泛應用，造成傳熱性的差異，一般要180-300秒才能溶解完全，每分鐘復溫25～50℃，在排除其它影響因素的情況下，復蘇率為40-80％。

發明內容

本發明目的是提供一種提高傳代細胞系凍存細胞復蘇率的復蘇方法，該方法能保持細胞壁的完整，溶解速度更快，以達到使細胞形態結構與生物學特性恢復的更完整，復蘇時間短，且復蘇率高。

為了達到上述發明目的，本發明是通過如下技術方案實現的：

本發明提供一種提高傳代細胞系凍存細胞復蘇率的復蘇方法，其特征在于步驟如下：

(1)從液氮中取出細胞凍存管，復蘇溫度46-67℃下水浴30-70秒，加入適配營養液，800轉/分，離心5分，棄上清，得離心后的細胞；

(2)離心后的細胞用適配營養液稀釋，無菌取細胞，用1％臺盼藍染色，計數活細胞數和細胞總數，計算復蘇率為95-98％；

(3)其余細胞加入適配生長液，靜止37℃培養5-7小時，至90-95％的細胞貼壁；

(4)更換細胞適配生長液繼續培養48-72小時，至細胞完全融合生長成單層；按比例傳代培養；完成細胞復蘇生長繁殖周期。

進一步，所述的復蘇溫度為55-60℃。

在復蘇過程中，冰晶在-50℃以上時進行得較快，因而緩慢解凍往往會由于重結晶而造成細胞死亡，迅速升溫可使重結晶的晶體數量減至最少，也可使細胞處在高濃度溶質中的時間縮到最短，以減少細胞的“滲透壓休克”，恢復細胞的正常生理功能。本發明與現有技術相比，復蘇溫度提高，復蘇時間縮短，溶解速度更快，復蘇速度分別可達100-250℃/min，復蘇時間在30-70秒，6小時后鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見約90-95％的細胞貼壁，細胞形態圓形，大小均勻，折光性好，有部分分支生長狀態，培養液中有少量懸浮圓縮的無活力細胞；最終的細胞復蘇率達90-98％，提高了傳代細胞系凍存細胞的復蘇率，保證了細胞生長質量，保持了細胞壁的完整，縮短了細胞復蘇的增殖周期。

通過下列實施例將更具體的說明本發明，但是所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何形式限制本發明的保護范圍。

具體實施方式