[發(fā)明專(zhuān)利]一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210003929.0
• 申請(qǐng)日: 2012-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533999A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高虹;吳戀;耿緒云;孫金生;潘寶平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 天津市杰盈專(zhuān)利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發(fā)明得到天津市自然科學(xué)基金?基礎(chǔ)研究計(jì)劃（10JCYBJC09100）天津師范大學(xué)博士基金項(xiàng)目(自然科學(xué))?項(xiàng)目號(hào)：52XB1004；天津師范大學(xué)市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金的資助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的特異性引物,更具體的說(shuō)是一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的方法。主要用于牙鲆TLR1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究和免疫學(xué)功能研究。

背景技術(shù)

隨著世界范圍水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)品貿(mào)易及水產(chǎn)苗種跨區(qū)域交流日益頻繁，大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原傳播的機(jī)會(huì)。同時(shí)，由于現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化、高密度生產(chǎn)方式及漁業(yè)水域環(huán)境的惡化，又常會(huì)引發(fā)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制。正是這些因素相互影響，出現(xiàn)了全球性的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病率趨于頻繁、流行程度日益廣泛、經(jīng)濟(jì)損失極為巨大的局面。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐，掌握病害的免疫防御技術(shù)是水產(chǎn)科技急需解決的首要問(wèn)題，因此，近年來(lái)國(guó)際上魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)的研究逐漸受到重視。

在人類(lèi)免疫學(xué)研究的歷史舞臺(tái)上,?細(xì)胞免疫和體液免疫一直是兩個(gè)主角。相比之下,?固有免疫的研究由于缺乏對(duì)其相應(yīng)受體的系統(tǒng)認(rèn)識(shí),?明顯滯后于獲得性免疫研究的進(jìn)程。20世紀(jì)90年代,?Janeway?等有關(guān)“病原體相關(guān)分子模式”以及“模式識(shí)別受體”概念的提出,?標(biāo)志著固有免疫研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。魚(yú)類(lèi)雖是低等脊椎動(dòng)物，但已具備免疫的基本特性，與哺乳動(dòng)物一樣，其體內(nèi)也存在2種免疫應(yīng)答類(lèi)型：固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。而相對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，魚(yú)類(lèi)的固有免疫研究才剛剛起步。

Toll樣受體（Toll-like?receptors，TLRs）家族是動(dòng)物識(shí)別入侵病原體的主要?“模式識(shí)別受體”，可識(shí)別幾乎所有病原生物的一些通用結(jié)構(gòu)，是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。一般認(rèn)為T(mén)LR?1、2、4、5和6主要參與細(xì)菌成分的識(shí)別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針對(duì)病毒成分，TLR9對(duì)這二者均能夠識(shí)別。TLR14、21～23在某些魚(yú)類(lèi)中存在，在哺乳動(dòng)物中還未發(fā)現(xiàn)。

牙鲆(Paralichthys?olivaceus)在我國(guó)俗稱(chēng)牙片、偏口、比目魚(yú)，是我國(guó)北方海水工廠化養(yǎng)殖的主要名貴魚(yú)類(lèi)品種，同時(shí)也是重要的海水增養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。牙鲆屬于鰈形目，鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚(yú)類(lèi)在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區(qū)。近年來(lái)，腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴(yán)重,該病從苗種到成魚(yú)均有發(fā)生,死亡率可達(dá)50%-80%。由于目前對(duì)牙鲆免疫機(jī)理和機(jī)制的了解較少，尚無(wú)有效的免疫防治技術(shù)和治療方法。

TLRs是宿主免疫的必需分子之一,?通過(guò)感知病原微生物體，識(shí)別病原相關(guān)分子模式，激活天然免疫系統(tǒng)，TLR1作為T(mén)LRs家族的成員，參與魚(yú)類(lèi)免疫調(diào)節(jié)。揭示牙鲆TLR1的免疫學(xué)功能及作用機(jī)理，將為尋找魚(yú)類(lèi)病害防治的新策略提供理論依據(jù)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。?

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR不僅實(shí)現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無(wú)須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中也得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:

設(shè)計(jì)一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的特異性引物，其特征在于包括符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的特異上下游引物：TLR1-q-F：5'-?TCCGCACTTCTCATCTTTAT?-3'；TLR1-q-R：5'-?ATTTCACCACAGCCCTTC?-3'；

以及作為內(nèi)參基因的牙鲆β-actin特異上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。

本發(fā)明所述特異性引物快速檢測(cè)牙鲆TLR1基因表達(dá)的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：