[發明專利]一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR1基因表達的方法

無效

• 申請號: 201210003929.0
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102533999A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高虹;吳戀;耿緒云;孫金生;潘寶平
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.?一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR1基因表達的特異性引物，其特征在于包括符合熒光PCR反應特點的特異性上下游引物：TLR1-q-F：5'-?TCCGCACTTCTCATCTTTAT?-3'；TLR1-q-R：5'-?ATTTCACCACAGCCCTTC?-3'；

以及作為內參基因的牙鲆β-actin基因特異性上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。

2.一種采用權利要求1所述的特異性引物快速檢測牙鲆TLR1基因的方法，其特征在于按如下步驟：

（1）使用下述引物進行該基因的檢測：

符合熒光PCR反應特點的該序列特異性上下游引物：

TLR1-q-F：5'-?TCCGCACTTCTCATCTTTAT?-3'

TLR1-q-R：5'-?ATTTCACCACAGCCCTTC?-3'

以及作為內參基因的牙鲆β-actin特異性上下游引物：

β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3'

β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'；

（2）總RNA提取與純化：采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從牙鲆頭腎中提取得到純化的牙鲆頭腎總RNA；

（3）cDNA第一鏈合成：以牙鲆頭腎總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系為20μL；

（4）實時熒光PCR：以上述合成的cDNA第一鏈為模板，上述（1）中TLR1-q-F和TLR1-q-R、β-actin-F和β-actin-R為特異性引物，進行實時熒光PCR擴增反映，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管的Ct值取平均數；

實時熒光PCR擴增體系設置如下：

Components每管成分Volume體積(μL)Hotstart Fluc-PCR mix 熱啟動熒光PCR混合物25Sense primer正向引物 (25 pmol/μL)1Anti-sense primer反向引物 (25 pmol/μL)1cDNA第一鏈 (μL)3ddH₂O (μL)20Total Volume總體積 (μL)50；

實時熒光PCR擴增參數設置如下：

94℃?4?min?；

94℃?30?s；60℃?30?s；72℃?30?s?(40個循環)；

72℃?10?min；12℃保溫；

（5）牙鲆頭腎組織中TLR1基因的相對表達量計算：實時熒光PCR完成后，根據Ct值計算牙鲆病原感染各時間段下的△Ct、2^-(ΔΔCt)值，計算方式如下：?

△Ct?=?Ct?—?Ct內對照（β-actin）

△△Ct?=△?Ct?—△Ct（0時健康牙鲆）

以2^-(ΔΔCt)?數值表示牙鲆頭腎中TLR1基因相對于健康牙鲆TLR1基因的表達量。

3.如權利要求2所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為25?μmol/L的貯存液，工作濃度為0.5?μmol/L。