[發(fā)明專利]檢測食品中沙門菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210003674.8
• 申請(qǐng)日: 2012-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN102424861A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 焦新安;張磊;潘志明;耿士忠;陳祥;黃金林;孫林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種食品中病原菌的快速檢測方法，特別是一種以HisJ為靶基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測食品中沙門菌的方法及試劑盒，屬于食品檢測生物技術(shù)領(lǐng)域，適用于食品中沙門菌屬的檢測。

技術(shù)背景

沙門菌是最常見的食源性疾病病原菌，不僅能導(dǎo)致動(dòng)物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙門菌作為致病菌檢測的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品安全、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均是必需檢測的項(xiàng)目，有重要社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的意義。傳統(tǒng)的沙門菌檢測常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，確診檢驗(yàn)結(jié)果至少需5～7天，檢驗(yàn)方法存在繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、特異性低等缺陷。因此，快速、準(zhǔn)確、簡便的沙門菌檢測方法將是發(fā)展的方向。建立一種能快速檢測沙門菌的檢測方法具有重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)是建立于鏈替換自動(dòng)循環(huán)反應(yīng)基礎(chǔ)之上。模板上的六個(gè)位點(diǎn)在恒溫條件下被四條基礎(chǔ)引物所識(shí)別并擴(kuò)增，這賦予了此技術(shù)高度的特異性。與其他方法相比，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增只需要一個(gè)可以保持60-65℃恒溫的簡單加熱裝置如水浴鍋。而且，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在合成大量DNA的同時(shí)伴有大量的白色硫酸鎂副產(chǎn)物，所以結(jié)果的判定只需肉眼簡單觀察濁度或通過加入DNA染料SYBR?GreenI后觀察顏色變化。HisJ基因被報(bào)道可以成功檢測沙門菌分離株并被證明是一個(gè)可靠的靶基因(G.G.Stone，R.D.Oberst，M.P.Hays，S.McVey，and?M.M.Chengappa，″Detection?of?Salmonella?serovars?from?clinicalsamples?by?enrichment?broth?cultivation-PCR?procedure，″Journal?ofClinical?Microbiology，vol.32，no.7，pp.1742-1749，1994；C.Gentry-Weeks，H.J.Hutcheson，L.M.Kim，D.Bolte，J.Traub-Dargatz，P.Morley，B.Powers，and?M.Jessen，″Identification?of?twophylogenetically?related?organisms?from?feces?by?PCR?for?detection?ofSalmonella?spp，″Journal?of?Clinical?Microbiology，vol.40，no.4，pp.1487-1492，2002)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測食品中沙門菌的方法，該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高靈敏地檢測食品中的沙門菌。

本發(fā)明通過以沙門菌種屬特異性基因HisJ為靶基因，設(shè)計(jì)了一組四條引物特異性擴(kuò)增HisJ基因以達(dá)到檢測沙門菌的目的。為了使檢測具有好的靈敏度與特異性，我們使用了BPW(蛋白胨水)進(jìn)行預(yù)增菌，使用了孔雀綠培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性增菌。獲得了高特異性高靈敏度的結(jié)果。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測食品中沙門菌的方法，采用GenBank登錄號(hào)為CP001363.1的沙門菌HisJ基因序列，設(shè)計(jì)一組四條引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C，以常規(guī)水煮裂解法提取的鼠傷寒沙門菌基因組DNA為模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，其步驟如下：

A、所述的引物序列為：

SALFIP：ttgcctttcagcgacgcgacttttctgattcccgtctggtggt；(SEQ?ID?NO.1)

SALBIP：tgctacaggggacgacgcagttttacgatctcaatccctttcgg；(SEQ?ID?NO.2)

SALF3：aggaaatcgcgtttaccgac；(SEQ?ID?NO.3)

SALB3C：gttgtcctgcccctggta.(SEQ?ID?NO.4)

B、所述的水煮裂解法步驟為：取細(xì)菌懸液1ml?8,000×g離心5分鐘，沉淀使用PBS懸浮并洗滌；接著再用8,000×g離心獲取沉淀并使用100μl超純水重懸細(xì)菌；使用煮沸法裂解細(xì)菌，即細(xì)菌懸浮液在100℃煮沸10min，12,000×g離心3分鐘，吸取上清作為模板；