[發明專利]檢測食品中沙門菌的環介導等溫擴增方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201210003674.8
• 申請日: 2012-01-06
• 公開（公告）號: CN102424861A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 焦新安;張磊;潘志明;耿士忠;陳祥;黃金林;孫林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種檢測食品中沙門菌的環介導等溫擴增方法，其特征在于以沙門菌HisJ基因為靶基因，使用四條環介導等溫擴增特異性引物檢測沙門菌，所述四條環介導等溫擴增特異性引物序列如SEQ?ID?NO1-4所示。

2.根據權利要求1?所述檢測食品中沙門菌的環介導等溫擴增方法，其步驟如下：

A、以水煮裂解法提取鼠傷寒沙門菌基因組DNA：取細菌懸液1ml?8,000?×?g離心5分鐘，沉淀使用PBS懸浮并洗滌；接著再用8,000?×?g離心獲取沉淀并使用100?μl超純水重懸細菌；使用煮沸法裂解細菌，即細菌懸浮液在100?℃?煮沸?10?min，12,000?×?g離心3分鐘，吸取上清作為模板；

B、將序列分別如SEQ?ID?NO1-4所示的一組4條引物SALFIP﹑SALBIP﹑SALF3和SALB3C與反應試劑組合，進行環介導等溫擴增檢測；

其反應體系為?25?μL，體系組成：引物SALFIP?和?SALBIP?各1.6?μM，引物SALF3和SALB3C?各0.4?μM，dNTPs?為1.6?mM，?硫酸鎂為6?mM，甜菜堿為1?M，8?U的Bst?DNA?聚合酶大片段，1×ThermoPol?緩沖液，和2?μl的樣品基因組DNA；

其反應程序：混合液在63?℃?孵育?60分鐘后，反應液在80?℃加熱3分鐘終止，觀察。

3.一種沙門菌檢測試劑盒，其特征在于包括：

試劑A:?2×預混反應緩沖液12.5×20?μL；

試劑?B:?反應酶液1×20?μL；

試劑?C:?預混引物干粉，在使用前加入40?μL超純水，2×20?μL；

試劑D為陰性對照1?mL；

試劑E為陽性對照1?mL；

試劑F?為SYBER?Green?I?1×20?μL。

4.一種沙門菌檢測試劑盒，其特征在于包括：

試劑A：10×ThermoPol?緩沖液50?μL，10?mM?dNTPs?80?μL，1?M?硫酸鎂3?μL，5?M甜菜堿100?μL，超純水17?μL；

試劑?B：8?U?Bst?DNA?聚合酶大片段20μL；

試劑?C：引物SALFIP?和?SALBIP?干粉各0.8?nmol，引物SALF3和SALB3C干粉各0.2?nmol；

試劑?D：超純水1?mL；

試劑?E：高純鼠傷寒沙門菌ATCC?14028s基因組模板1?mL?(10?ng/μL)；

?試劑F：10000×SYBER?Green?I?2?μL，?DMSO?18?μL。