[發明專利]一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法

無效

• 申請號: 201210003616.5
• 申請日: 2012-01-07
• 公開（公告）號: CN102559822A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 侯虎;李八方;趙雪;張朝輝
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;G01N27/327;G06N3/02
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 崔清晨

技術領域

本發明屬于生物技術酶工程技術領域，具體涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，可在生物活性肽的制備過程中動態監測水解過程，實現水解的可視化，從而最大程度的獲取目標活性肽。

背景技術

近年來已發現一些天然免疫活性肽如胸腺肽，可誘導淋巴細胞分化、增殖與成熟，提高免疫低下小鼠的免疫活性。然而天然免疫活性肽在生物體中含量較少，制備成本高，價格昂貴。雖然化學方法可以大量合成免疫活性肽，但化學合成的免疫活性肽存在副反應和副產物較多的問題，其應用和發展受到限制。而酶法水解具有成本低、安全性好，并且易于大量制備等優點，因此目前生物活性肽的制備研究主要集中在酶法水解上面。

但是蛋白酶解的程度對于活性肽的免疫效果具有重要的影響，其可以用水解度來表示。隨著對生物活性肽生理功能認識的不斷深入，發現水解度對酶解產物的生物學活性、活性組分得率、肽段組成和分子量分布均有影響。適當控制酶解條件和水解度可以提高生物活性肽的生成量。例如，對乳鐵蛋白水解產物的抑菌活性與水解度進行相關分析發現，在一定水解度范圍內(DH小于10％)，隨著乳鐵蛋白水解度的提高，酶解產物的抑菌活性增強，但是水解度過大時酶解產物的抑菌活性卻發生下降。因此，確定水解度就對于蛋白酶解產物的免疫調節活性具有重要作用，而實現蛋白酶的可控水解也就具有重要的意義。

目前國內外的可控酶解的理論與方法主要集中在數學動力學模型模擬和酶解進程控制上，這為生物活性肽的制備及工業化應用提供了有益的參考。但目前對蛋白酶促水解反應的動力學研究發展較緩慢，其原因是雖然在方程中引入了產物抑制常數和底物常數，但大多仍停留在用米氏方程描述反應過程階段。同時，由于酶解過程是一個相當復雜的過程，易受到各種外界條件影響，如溫度波動、pH變化、酶活變化、攪拌速率不同、底物多樣化等等，使得數學動力學方程十分繁瑣復雜、難于真實地描述反應的全過程。因此動力學模型是有局限性的，完全依靠動力學模型難以實現酶解的可控操作，新的可控酶解理論與技術成為生物活性肽制備中亟待解決的重要課題。

而生物傳感器可以在線直接或間接監測酶解過程中產生的活性肽含量和分子量分布，可以有效實現活性肽的可控制備，顯示出巨大優勢。生物傳感器技術把生物活性物質的檢測，巧妙地與傳感器技術、計算機輔助控制方法相結合，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜體系中進行在線連續監測等特點。其原理是：在傳感器的化學電極的敏感面上組裝固定化酶膜，當酶膜接觸待測物質時，該膜對待測物質作出響應，催化它的固有反應，轉化為電極中的電流或電位的變化，由計算機撲捉電信號，轉化為測定該物質的數量數據。這樣生物傳感器就能夠快速、可靠地獲得酶解過程中某種或幾種特定的氨基酸含量來間接反映產物水解度和多肽分布的信息，實現酶解的在線動態監測，為生物免疫活性肽制備的全自動控制提供了可能。所以，基于生物傳感器建立的人工神經網絡(Artificial?Neural?Networks，ANNs)可用來實現生物活性肽制備的可視化。其具有自學習、自組織和自適應功能，可以充分逼近任意復雜的非線性關系，大規模并行處理，使快速進行大量運算成為可能，有很強的魯棒性和容錯性。正是由于BP-ANNs獨特優勢，構建鱈魚免疫活性肽制備的動態監控模型具有可行性。因此，在線動態監控模型的建立將為鱈魚蛋白免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發奠定了理論基礎和技術支持。但根據文獻調研和國內外查新結果可知，生物傳感器在生物活性肽的酶法制備研究中尚未有報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，從而解決目前沒有能夠及時準確地在線監控鱈魚免疫活性肽酶解制備的問題，為免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發提供技術支持，為鱈魚免疫活性肽實現在線控制制備提供了可操作依據。可應用于生產鱈魚免疫活性肽及其他生物活性肽的在線監控制備。

本發明的一個方面確定鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16～17％時終止水解而制備的。

本發明的另一個方面涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，包括如下的步驟：

1)建立并訓練人工神經網絡，包括網絡訓練樣本的制備、參數確定以及網絡的訓練步驟；

A、網絡訓練樣本的制備：訓練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進行測定；