[發明專利]分子結構和功能的測定方法

無效

• 申請號: 201210003078.X
• 申請日: 2012-01-06
• 公開（公告）號: CN102590525A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: J.弗勒斯;M.D.貝拉爾迪諾;K.蘇基哈拉;T.扎貝利
• 申請（專利權）人: 阿克塞特里斯股份公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/33;G01N21/64
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李連濤;劉健

本發明涉及測量跨過細胞膜或脂雙層(lipid?bilayer)的轉運過程的方法，其至少包含具有頂面和背面和多個納米孔或微孔的基底和從細胞膜的兩面均可進入的覆蓋所述多個孔的細胞膜。

多種重要的生物反應，如能量轉換、儲存、免疫反應和信號傳遞在細胞膜處發生并通過膜蛋白進行。另一方面，藥物透過膜本身的滲透性是制藥工業中的重要問題，因為許多藥物必須滲透該膜才能到達它們在細胞內的靶。但是，研究這些膜蛋白（全細胞膜片鉗法(whole?cell?patch-clamp?methods)）和膜滲透性（Caco-2或PAMPA滲透性檢測法）的傳統方法具有許多缺點，這使它們作為藥物篩選法的標準工具的應用復雜化。

芯片可用于監測膜轉運過程，尤其是跨過生物膜的藥物滲透或跨過含離子通道的膜的離子轉運。這種芯片從WO?2005/064342中獲知，其詳細描述了這種芯片的使用背景和益處。其還描述了作為生物有效層的膜，其是細胞膜或脂雙層，以及該芯片的功能和結構。

一類重要的膜蛋白是G-蛋白偶聯受體（GPCR），其構成細胞膜受體的最大亞類。這些受體的大約一半被視為藥物的靶。GPCR充當從細胞外部向內部傳送信號（如光子、氣味劑、激素和神經遞質）的信號轉導蛋白，其中通過相應的G-蛋白引發各種類型的反應級聯。G-蛋白共價錨定到脂雙層且目前根據α-亞基的性質分成四族，它們與不同的靶膜蛋白（target?membrane?proteins），如酶或離子通道相互作用。在G-蛋白離解后，α-亞基在脂雙層內側向擴散，鍵合到靶蛋白上并激活該靶蛋白。在下面略述的體外檢測系統的幾乎所有情況下，組成未知的生物膜固定在固體載體上，這通常造成脂雙層的有限流動性和膜蛋白的結構擾動（structural?disturbance）。因此，在大量藥物篩選活動中非常不希望遇到這些情況，因為在檢測過程中，可能極大干擾蛋白質的天然功能。

第二類重要的膜蛋白是離子通道。這些電壓-或配體-門控的通道以下述事實為特征：它們將沿它們的電化學梯度向下（down?to?their?electrochemical?gradient）跨膜傳送大量離子（達到10⁸個離子/秒）。這通過這些蛋白質的構象變化實現，其可以在數毫秒內打開和關閉它們的通道結構。許多已知疾病，如心力衰竭，與特定離子通道的功能障礙相關聯，這因此也被踴躍研究。對離子通道的功能和結構研究的選擇方法是膜片鉗技術。這種技術由通過在膜各側上放置電極來利用這些蛋白質的高離子轉運速率的電化學測量構成。通過使用該提出的高度復雜的檢測系統，實現對相關膜蛋白的功能的更深入洞悉。學術研究和藥物發現都獲益于這種認識。

第三類重要的膜蛋白是轉運蛋白。與離子通道相反，它們能在能量消耗下逆著電化學梯度跨過生物膜主動轉運離子或其它分子。但是，與離子通道相比，這些蛋白質的轉運速度（速率）遠低于離子通道（轉運蛋白(transporter)最多10⁴?/秒?vs.?通道10⁸?/秒），使得主動轉運蛋白不適合電化學測量。

除蛋白質介導的信號轉導和轉運過程外，另一可能是分子有可能穿過脂雙層：簡單（被動）擴散。這一方面對必須以高速率穿過膜但由于小且溶劑化差而可以獨力完成這一點的分子如O₂和CO₂而言是重要的，另一方面對不存在特異性載體以促進細胞滲透的許多藥物是重要的。藥物通過穿透腸內側（lining）的細胞而吸收到血流中的能力因此代表制藥公司的藥物剖析法（drug?profiling?process）中的重要參數。由于大部分藥物（>80%）通過被動擴散穿過腸上皮來進入血流，預測口服藥物的被動滲透的檢測法變得越來越重要。

通常通過經UV-分光光度檢測或在這些化合物不吸收紫外線的情況下經LC-MS（液相色譜-質譜法）分析測量各化合物的濃度來進行藥物候選物的被動擴散的測定。對UV-分光光度分析而言，上文提到的人工膜檢測和Caco-2細胞基檢測都沒有提供在線測定濃度的可能性，因為浸漬的過濾器在光學上不適合透射測量。任選地，也可以使用任何其它不常見的已知測定方法。

上文提到的現有技術芯片用于穿過膜孔的電化學測量。被動擴散法尤其需要在多個小時的總測量期間穩定的膜。已知的膜在孔區域中缺乏充足的穩定性，這以不合意的方式影響測量結果?；字辽侔璞砻?。

因此，本發明的目的是提供在用于生物傳感器和藥物篩選應用的芯片基膜系統中的改進的光學測量方法，其適用于工業生產和通用用途。