[發明專利]一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法

有效

• 申請號: 201210002623.3
• 申請日: 2012-01-06
• 公開（公告）號: CN102565382A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李冬冬;趙文姬;張逸南
• 申請（專利權）人: 蘇州浩歐博生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 汪青

技術領域

本發明涉及一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。

背景技術

免疫層析是出現于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體（如抗體或抗原）發生高特異、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域（檢測帶），通過酶反應或直接運用可目測的標記物（如膠體金）而得到直觀的實驗現象（如顯色）。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。

免疫層析技術目前已廣泛應用于臨床醫療檢測中。國內外現有的商品供應及文獻報道的檢測項目主要包括以下方面：違禁藥物檢測（苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等）、傳染病病原檢測（梅毒螺旋體、淋球菌、沙眼衣原體、幽門螺桿菌等）、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病檢測標志物等。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。

由于正常情況下血清IgE抗體僅在ng/ml水平，用常規測定IgG或IgM的凝膠擴散法檢測不出IgE，因而目前常采用免疫層析法來進行檢測。然而，現有的進行血清IgE抗體檢測的免疫層析法將特異性過敏原直接連接到標記物乳膠微球上形成過敏原-乳膠微球復合物，相當于一比一的連接關系，靈敏度低，用于檢測ng/ml水平的特異性IgE抗體時，檢測結果顏色暗淡，不容易觀察。

生物素-親合素系統（Biotin-Avidin-System，BAS）是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。近年大量研究證實，生物素-親合素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素-親合素與標記試劑高親合力的牢固結合及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種改進的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。

為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案：

一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結合墊、包被有檢測線和質控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進行檢測，其特征在于：所述結合墊上結合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，所述方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合形成結合物，以及所形成的結合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現色帶來實現對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。

根據本發明的進一步實施方案：所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球通過如下方法制備：首先將過敏原與生物素連接形成過敏原-生物素，將親合素與乳膠微球連接形成親合素-乳膠微球，然后再將所形成的過敏原-生物素與所形成的親合素-乳膠微球連接，即得。

根據本發明的一個具體方面，過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的具體制備過程如下：

①將過敏原溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，將生物素溶于去離子水中，然后將生物素的水溶液滴加至過敏原的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌，得到含有過敏原-生物素的溶液；

②將親合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液（MES）中，將乳膠微球儲存液劇烈震蕩，取出微球于離心管中，離心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液，劇烈震蕩，加入溶有親合素的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液和新鮮配制的碳二亞胺溶液（EDC），劇烈震蕩，使混合均勻，在室溫暗室孵育20～40分鐘，加入吐溫-20，離心，除去上清，加入十二烷基硫酸鈉水溶液（SDS）溶解微球，劇烈震蕩，離心，除去上清，加入磷酸鹽緩沖液溶解微球，劇烈震蕩，得含有親合素-乳膠微球的溶液；

③將步驟①制得的含有過敏原-生物素的溶液加入步驟②制得的含有親合素-乳膠微球的溶液中，輕輕攪拌直至微球全部懸浮起來，然后在室溫下持續攪拌10～15小時，即得含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液。

根據本發明，通過噴涂所述含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液使過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合到結合墊上。