[發明專利]一種快速準確檢測番茄黃化曲葉病毒的方法

有效

• 申請號: 201210000614.0
• 申請日: 2012-01-04
• 公開（公告）號: CN102426234A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 喬寧;李美芹;竺曉平;劉永光;王興翠;國家進
• 申請（專利權）人: 濰坊科技學院;山東農業大學;山東省蔬菜工程技術研究中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/31
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種快速準確檢測番茄黃化曲葉病毒的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）從感染黃化曲葉病毒病的番茄病葉中提取總DNA，以此為模板通過PCR擴增獲得TYLCV-CP基因的特異性DNA片段，所用引物為：

TYCP1：5’-GCG?GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’，?下劃線為EcoRI酶切位點，

TYCP2：5’-GCG?CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3’，?下劃線為Xho?I酶切位點；

（2）將TYLCV-CP基因片段與表達載體pET-32a連接，轉化受體菌獲得抗性菌落，篩選出陽性克隆，然后在含有0.1-0.5?mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的條件下進行誘導表達，離心收集菌體，菌體破碎后純化目的蛋白；

（3）以純化的目的蛋白為抗原免疫家兔，效價為1:16000時采血收集抗血清，將抗血清純化，獲得純度為95-98%，濃度為20-24.3mg/mL的抗體IgG；

（4）用戊二醛一步法對純化的抗體進行堿性磷酸酶標記，獲得堿性磷酸酶標記抗體IgG-AP，其中?IgG濃度為0.822-1.145mg/mL；

（5）以健康的幼苗為陰性對照，以感病幼苗為陽性對照，純化的IgG包被后與堿性磷酸酶標記抗體IgG-AP對待檢樣品進行DAS-ELISA檢測，最后加入PNPP配成的底物溶液進行顯色；其中IgG包被濃度為6.25μg/mL，酶標抗體稀釋度為1:400；

IgG包被條件為4℃過夜，封閉時間為60min；

酶標抗體作用時間為120min，底物顯色條件為37℃條件下30min。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4）對純化的抗體進行堿性磷酸酶標記時，將1mg純化的IgG與800IU的堿性磷酸酶混勻，加PBS緩沖液到0.5mL；在其混合液中加入4μL?25%戊二醛，室溫放置2h，每30min上下顛倒一次；4℃中用PBS緩沖液透析過夜，透析物轉移至離心管中，加入5mg牛血清白蛋白，4℃保存備用。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟（2）純化目的蛋白為使用蛋白純化柱HiTrap?Chelating?HP?純化。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于抗血清純化時使用抗體純化柱：l?mL的HiTrap?Protein?A?抗體純化柱。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟（2）中受體菌為E.coliBL21(DE3)。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于底物溶液為將5mg對硝基苯磷酸二鈉溶于7.5mL的含11.6%二乙醇胺的pH為9.8的底物緩沖液中。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于TYLCV-CP基因的PCR擴增反應體系為：2x?Taq?MasterMix?12.5?μL，10?pmol/L的?TYCP1??1.0?μL，10?pmol/L?的TYCP2??1.0?μL，模板DNA?1.0μL，加雙蒸水至終體積25.0?μL；PCR反應條件為94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環，72℃繼續延伸10min。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟（2）中誘導表達步驟如下：將獲得的陽性菌落接種到LB液體培養基中，37℃培養過夜，將該培養物以1:100的比例轉入新鮮的LB液體培養基中，37℃培養至OD₆₀₀為0.8時，分組加入IPTG使其終濃度分別為0.1mmol/L、0.3mmol/L和0.5mmol/L，37℃誘導表達4?h。