[發明專利]通過生物技術方法獲取低聚糖

有效

• 申請號: 201180071512.1
• 申請日: 2011-06-07
• 公開（公告）號: CN103764835A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 以斯帖·馬特恩寇·希拉;薇若妮卡·納瓦羅·巴雷拉;瑪利亞·恩里克·洛佩斯;瑪爾塔·托塔哈達·塞拉;杜尼婭·盧科維奇;迭戈·羅德里格斯·吉梅內斯;丹尼爾·拉蒙·威代爾;比阿特麗斯·阿爾瓦雷斯·佩雷斯
• 申請（專利權）人: 海羅公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/18;C07H3/06;C12N1/19;C12R1/865;C12R1/685;C12R1/46
• 代理公司: 北京萬慧達知識產權代理有限公司 11111
• 代理人: 戈曉美;段曉玲

技術領域

本發明涉及通過生物技術手段獲取存在于母乳中的特定低聚糖，尤其是乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose）和乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose）。

背景技術

低聚糖為天然存在于水果、蔬菜、人乳以及蜂蜜中的短鏈碳氫化合物（聚合度為2-7）。由于其生物及生理特性，它們作為功能成分尤其是其益生元活性被認為是非常重要的。

存在于人乳中的低聚糖具有重要的生物作用，因為它們可能與新生兒的抗感染有關。它們通過阻止某些病原體（病毒和細菌）粘附在腸的上皮組織，引發局部免疫系統，充當益生元的作用。

母乳中包括130種以上不同的低聚糖，是第三豐富的組分。母乳哺育進行一年后其中的低聚糖含量低于初始數星期的一半。測量發現低聚糖在不同動物乳汁中的質量和數量有所不同。人乳低聚糖中最豐富的單體為D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-海藻糖、N-乙酰甘露糖胺丙酮酸。所有的這些單體通過加成L-海藻糖和/或唾液酸基團而被修飾，分別生成所謂的中性或酸性低聚糖，其中的150-200已經被描述。隨著母乳哺育進行，它們在乳汁中的含量下降，然而，似乎在頭幾個月具有相關生理作用。

乳糖通過糖基轉移酶（GT）形成最重要的中性低聚糖，例如人乳中形成的最豐富的中性低聚糖是乳糖-N-丙糖（lacto-N-triose）和乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose）以及乳糖-N-巖藻五糖（lacto-N-fucopentaose）的不同異構體。母乳中未被消化的低聚糖部分刺激了結腸中雙歧桿菌的生長，并且這些菌落對保護預防腸道感染有益。因此，低聚糖是先天免疫系統的主要成分，通過母乳哺育過程媽媽們保護她們的孩子遠離病原體（腸道病原體或作用其他部分的病原體）。

值得注意的是，在山羊奶，綿羊奶以及牛奶中沒有發現這些產品。并且，這些產品不存在與人造奶中，所以，向人造奶中添加它們具有明顯的社會和經濟效益。在此意義上，對于它們的生產和隨后的應用有四種可能。

ⅰ）第一種可能是從人奶中純化它們。這個選擇是不可取的，因為缺乏原材料。

ⅱ）第二種可能是化學合成。雖然這是可能的，但它們的成本高且效率低。

ⅲ）第三種選擇是以使用酶為基礎通過乳糖生產不同的低聚糖。該計劃是基于使用來自不同來源（微生物或哺乳動物）的不同的糖苷酶和糖基轉移酶。優選使用具有更高效率的糖基轉移酶，然而由于它們中許多來源于動物而太過昂貴。因此，在不同微生物（大腸桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母）中表達基因編碼這樣的一種酶的工作已經實施，其目的是過度生成它們，雖然該途徑從沒達到半工業化規模。

ⅳ）最終，最后的計劃包括通過遺傳工程技術構建能夠生產低聚糖的微生物。在此意義上，通過表達腦膜炎雙球菌的三個基因取得了初步進展，在大腸桿菌菌株中編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶、半乳糖轉移酶以及唾液酸轉移酶，其中乳糖轉移者的表達即編碼基因可以通過甘油誘導。雖然該方法取得成功，將獲得產品用于嬰兒食品的銷售是復雜的，因為致病的細菌是基因的供體和受體且獲得的材料是產生于要求特殊標記的轉基因生物體。當在發酵罐中生長且透性化，不同的轉基因細菌能夠生產不同的酶活性體，并且涉及合成感興趣的低聚糖的細胞前體也已經成功構建。所述方法涉及四種不同的微生物使得其工業應用的可能困難。

關于該領域現狀在本文件中進行描述，較早方法如JP11253191A，提供了一種酶促合成乳糖-N-四糖的方法，適合以任何劑量用于食品及藥用產品中。該方法包括在β-1、3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶的存在下UDP-葡萄糖酰胺（UDP-GlcNac）在乳糖上反應，合成乳糖-N-丙糖，隨后在β-半乳糖苷酶存在下與半乳糖結合，因此得到乳糖-N-四糖。

文件US2007/0275881?A1涉及藥劑組分及其在治療傳染性疾病中的用途。這些組分包括綁定在感興趣的低聚糖（例如乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖）上的多肽。該文件描述這些低聚糖是在相應糖基轉移酶存在下在酵母菌中獲取。

發明文件US7521212?B1涉及通過微生物方法生產低聚糖，例如在乳糖和葡萄糖酰胺以及酶β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶和β-1-4-半乳糖基轉移酶的存在下，得到乳糖-N-新四糖。其也描述了獲取中間產物乳糖-N-丙糖。