[發明專利]通過生物技術方法獲取低聚糖

有效

• 申請號: 201180071512.1
• 申請日: 2011-06-07
• 公開（公告）號: CN103764835A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 以斯帖·馬特恩寇·希拉;薇若妮卡·納瓦羅·巴雷拉;瑪利亞·恩里克·洛佩斯;瑪爾塔·托塔哈達·塞拉;杜尼婭·盧科維奇;迭戈·羅德里格斯·吉梅內斯;丹尼爾·拉蒙·威代爾;比阿特麗斯·阿爾瓦雷斯·佩雷斯
• 申請（專利權）人: 海羅公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/18;C07H3/06;C12N1/19;C12R1/865;C12R1/685;C12R1/46
• 代理公司: 北京萬慧達知識產權代理有限公司 11111
• 代理人: 戈曉美;段曉玲

1.一種生產乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的方法，該方法包括使用至少一種微生物培養基進行反應，該培養基具有從乳糖生產乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的酶的活性，該方法包括：

a)在β-（1,3）-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶的存在下加入N-乙酰氨基葡萄糖以形成乳糖-N-丙糖，并且

b)在β-半乳糖轉移酶的存在下加入半乳糖以形成乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖，

c)允許乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的積累，并且

d)從所述反應混合物中恢復乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖。

2.根據權利要求1所述的微生物方法，其特征在于用于生產乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖所需的酶通過釀酒酵母屬的轉基因酵母菌產生。

3.根據權利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一種來自釀酒酵母屬的酵母菌攜帶了包含有序列表編號1的黑曲霉nagA基因的重組載體，該基因表達的酶具有β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶活性。

4.根據權利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一種來自釀酒酵母屬的酵母菌攜帶了包含有序列表編號2的嗜熱鏈球菌lacZ基因的重組載體，該基因表達的酶具有β-半乳糖基轉移酶活性。

5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于來自釀酒酵母屬的單一的酵母菌攜帶了一種或多種載體包含有序列表編號1的黑曲霉nagA基因，該基因表達的酶具有β-1-3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶活性，和序列表編號2的嗜熱鏈球菌lacZ基因，該基因表達的酶具有β-半乳糖基轉移酶活性。

6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶和/或β-半乳糖基轉移酶的活性從液體培養基、細胞提取物或培養介質中純化的酶中恢復。

7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于該方法的所述步驟（a）在43-47℃中持續大約70-74小時。

8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于該方法的所述步驟（b）在45℃中持續大約72小時。

9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于其另外包含萃取和純化步驟（a）中得到的乳糖-N-丙糖的步驟。

10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于在步驟（b）中使用的β-半乳糖基轉移酶是β-1-3-半乳糖基轉移酶來形成乳糖-N-四糖和/或β-1-4-半乳糖基轉移酶來形成乳糖-N-新四糖。

11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖從源自富含nagA活性的培養基和具有lacZ活性的細胞提取物體內獲取，nagA活性和lacZ活性源自釀酒酵母屬的單一的酵母菌表達且分泌序列表編號1的nagA基因且表達且不分泌序列表編號2的lacZ基因。

12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖從源自富含nagA活性的培養基和具有lacZ活性的細胞提取物體內獲取，nagA活性和lacZ活性源自釀酒酵母屬的單一的酵母菌表達且分泌序列表編號1的nagA基因并且表達且分泌序列表編號2的lacZ基因。

13.根據權利要求1-12的方法獲取的乳糖-N-丙糖、乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖，在食品產品中作為食品成分的用途。