[發(fā)明專(zhuān)利]針對(duì)中間位的單克隆抗體框架結(jié)合界面、中間位投遞系統(tǒng)及其使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201180059323.2
• 申請(qǐng)日: 2011-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103501815A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J.C.威廉斯;J.M.唐納森;D.A.霍恩;Y.馬;C.澤;K.布齊梅克;K.N.阿弗里
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 希望之城公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/395
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/395;A61K39/00;A61K39/38;C07K16/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 岑曉東

優(yōu)先權(quán)要求

本申請(qǐng)要求2010年10月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)61/391,558的權(quán)益，其通過(guò)提述完整并入本文。

發(fā)明背景

癌癥通過(guò)主動(dòng)抑制免疫系統(tǒng)來(lái)避開(kāi)免疫監(jiān)視。一種預(yù)想用于抵消此免疫抑制的方法是經(jīng)由利用由腫瘤細(xì)胞獨(dú)特地表達(dá)或過(guò)表達(dá)的抗原表位的疫苗接種。例如，已經(jīng)在臨床中成功執(zhí)行阻斷信號(hào)傳導(dǎo)途徑、扣留生長(zhǎng)因子和/或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的單克隆抗體（單抗）以治療癌癥和其它疾病。由于單抗的有利特性和臨床成功，其已經(jīng)是并且繼續(xù)是強(qiáng)烈蛋白質(zhì)工程化努力的主題。這些努力已經(jīng)得到實(shí)現(xiàn)改善的靶向的雙特異性單抗；實(shí)現(xiàn)較好的腫瘤穿透和血液清除的單鏈Fab可變片段(scFv)、雙抗體和微型抗體(minibody)；和改變免疫刺激或改善藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)特性的經(jīng)修飾的Fc（經(jīng)由突變或糖基化得到）。類(lèi)似地，單抗已經(jīng)再工程化改造為允許位點(diǎn)特異性綴合小分子以實(shí)現(xiàn)改善的投遞（例如ThioMAB）或不可逆地結(jié)合其抗原（例如無(wú)限的親和力單抗）。單抗還已經(jīng)開(kāi)發(fā)為改善生物活性肽和其它生物制劑的循環(huán)和呈現(xiàn)（例如CovXbody）。亦已經(jīng)開(kāi)發(fā)出與親合素融合的單抗或scFv或異多聚體scFv以進(jìn)行預(yù)靶向療法及改善腫瘤成像的檢測(cè)限。

盡管單抗可以是有效的且相對(duì)于小分子辦法具有一些優(yōu)點(diǎn)，但是諸如由于脫靶相互作用導(dǎo)致的不良副作用或由于綴合有放射性核素的單抗的長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間導(dǎo)致的伴隨損傷等限制指示仍有相當(dāng)大的空間來(lái)改善其效力，包括改善的靶向和協(xié)同。因此，增強(qiáng)抗體和小分子治療效力在癌癥和其它疾病的治療中會(huì)是有用的且期望的。

發(fā)明概述

顯示了抗體結(jié)合肽C-QFDLSTRRLK-C(cQFD;SEQ?ID?NO:1)和C-QYNLSSRALK-C(cQYN;SEQ?ID?NO:2)具有新的單抗結(jié)合特性。具體地，顯示了cQFD和cQYN（其亦稱(chēng)作“中間位(meditope)”）結(jié)合抗EGFR單抗西妥昔單抗(cetuximab)的Fab框架區(qū)，而不與結(jié)合抗原的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)結(jié)合。Fab框架上的該結(jié)合區(qū)與其它框架結(jié)合抗原如超抗原葡萄球菌蛋白A(SpA)(Graille等，2000)和大消化鏈球菌(Peptostreptococcus?magnus)蛋白L(PpL)(Graille等，2001)截然不同，并且先前是未知的。因而，第一個(gè)實(shí)施方案是一種框架結(jié)合界面，其包含獨(dú)特的鼠-人抗體或其功能性片段的框架區(qū)，所述框架區(qū)結(jié)合具有序列CQFDLSTRRLKC(SEQ?ID?NO:1)或CQYNLSSRALKC(SEQ?ID?NO:2)的環(huán)狀中間位。

通過(guò)表面等離振子共振對(duì)中間位的表征指示，cQFD和cQYN分別以約0.70-0.95和2-5μM的解離常數(shù)結(jié)合Fab。設(shè)計(jì)為破壞特異性相互作用的點(diǎn)突變進(jìn)一步支持該結(jié)構(gòu)模型。FACS分析揭示高濃度的cQFD中間位(60μM)在西妥昔單抗結(jié)合MDA-MB-468細(xì)胞（其過(guò)表達(dá)EGFR受體）的能力中產(chǎn)生可忽略的差異。如此，中間位結(jié)合不影響抗原結(jié)合。另外，將中間位與熒光基團(tuán)綴合，并且顯示了其結(jié)合用西妥昔單抗預(yù)處理的MDA-MB-468細(xì)胞，但是不結(jié)合用鼠抗EGFR抗體M425預(yù)處理的MDA-MB-468細(xì)胞（圖29）。這些數(shù)據(jù)共同限定Fab框架內(nèi)的中間位結(jié)合界面，并且證明中間位結(jié)合不抑制抗原結(jié)合（例如不起變構(gòu)調(diào)節(jié)物的作用）。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用具有上文所描述的新穎結(jié)合特性的中間位（例如cQYN或cQFD）或其變體來(lái)向治療性單克隆抗體（“單抗”）添加功能性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以利用本文中描述的中間位來(lái)影響治療性物質(zhì)如單克隆抗體及其功能性片段或其它物質(zhì)如小分子的效力。在又一個(gè)實(shí)施方案中，為了診斷或治療用途可以將標(biāo)簽或可檢測(cè)標(biāo)記物附接于中間位以鑒定某些細(xì)胞或組織類(lèi)型。

在一個(gè)分開(kāi)的實(shí)施方案中，中間位含有半胱氨酸，其共價(jià)結(jié)合Fab中在中間位結(jié)合位點(diǎn)處的半胱氨酸。將中間位與任何物質(zhì)、分子或化合物（其可以是治療性分子如小分子診斷分子，如標(biāo)志物）綴合。“Cys中間位”將綴合物引導(dǎo)至IgG，并且經(jīng)由共價(jià)連接結(jié)合。

附圖簡(jiǎn)述