[發(fā)明專利]短RNA分子

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201180054998.8
• 申請(qǐng)日: 2011-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN103314108A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·賽特羅姆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 米納治療有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113
• 代理公司: 北京邦信陽(yáng)專利商標(biāo)代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;楊敬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生成能夠生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的方法。該方法包括使用能夠增加MafA的表達(dá)的短RNA分子。本發(fā)明還涉及到這種短RNA分子和它們?cè)谥委熤械膽?yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病影響全球至少2億人。當(dāng)身體無(wú)法生產(chǎn)足夠量的胰島素（調(diào)節(jié)血液中葡萄糖水平的激素）時(shí)就會(huì)出現(xiàn)糖尿病。在健康個(gè)體中，胰島素是由胰腺，更具體是由胰腺β細(xì)胞生成的。I型糖尿病通常是由免疫系統(tǒng)的T-細(xì)胞破壞胰腺的β-細(xì)胞造成的，因此自身免疫紊亂通常是根本原因，雖然感染、尤其是病毒感染，或者傷害也能夠引起胰腺β-細(xì)胞的破壞或紊亂。這將導(dǎo)致胰島素產(chǎn)量的嚴(yán)重匱乏。

目前的治療選擇主要依靠施用外源性胰島素。其缺點(diǎn)包括對(duì)病人的不便，并且該種方法難以微調(diào)，通常會(huì)導(dǎo)致在某些情況下胰島素過(guò)量，在其他時(shí)候胰島素過(guò)少。

世界各地的I型糖尿病的發(fā)病率逐漸增加，相伴的，在這些患者中維持活性胰島素分泌的穩(wěn)定來(lái)源的臨床挑戰(zhàn)，使得向?qū)ふ覍?shí)現(xiàn)這一目的的其他機(jī)制中投入了相當(dāng)多的努力。然而，目前嘗試的再生胰島細(xì)胞或移植胰島細(xì)胞并不完全有效，因此對(duì)于產(chǎn)生胰島素生成細(xì)胞仍然存有需要。

能夠從增加胰島素產(chǎn)量中獲益的其他疾病包括II型糖尿病、脂肪肝、肥胖癥（尤其是病態(tài)肥胖癥）以及與葡萄糖和/或胰島素生成、攝取和/或利用缺陷相關(guān)的任何其他疾病。

胰腺由兩個(gè)隔室，外分泌及內(nèi)分泌隔室組成，每一個(gè)具有不同的功能。內(nèi)分泌隔室由朗格漢斯小島組成，所述朗格漢斯小島由合成肽激素胰島素(β-細(xì)胞)、胰高血糖素（α-細(xì)胞）、促生長(zhǎng)素抑制素（δ-細(xì)胞）和胰多肽（γ-細(xì)胞）的四種細(xì)胞類型簇組成。這些細(xì)胞已被證明在胚胎發(fā)育過(guò)程中從導(dǎo)管上皮干細(xì)胞通過(guò)連續(xù)分化而進(jìn)行分化。胰腺源于前腸內(nèi)胚層的背側(cè)及腹側(cè)區(qū)域的不同的胚胎分支，這些分支生成了內(nèi)分泌及外分泌細(xì)胞（13）。最早已知的胰腺標(biāo)志物的表達(dá)包括Hlxb9和PDX1同源異型框蛋白。這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)胰腺特異性的主信號(hào)發(fā)生響應(yīng)并在形態(tài)發(fā)生前指示胰腺干細(xì)胞。PDX1對(duì)于胰腺上皮的形態(tài)發(fā)生和分化是必要的。胰高血糖素和胰島素表達(dá)開始于下游的蕾狀期。PDX1還會(huì)生成神經(jīng)原素3(Ngn3)陽(yáng)性細(xì)胞作為內(nèi)分泌世系的起源。隨后Ngn3的激活啟動(dòng)了其他轉(zhuǎn)錄因子包括NeuroD1、Rfx6和MafA的表達(dá)，繼而引導(dǎo)細(xì)胞分化成為成熟的胰島細(xì)胞（20，21）。乙胞素過(guò)表達(dá)已被證明會(huì)誘導(dǎo)胰島素分泌。

胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中其被折疊并且其二硫鍵被氧化。胰島素原繼而被運(yùn)送至高爾基體，在該處被包裝進(jìn)入分泌囊泡，在分泌囊泡中經(jīng)過(guò)一系列蛋白酶的處理，形成成熟的胰島素。成熟的胰島素少了35個(gè)氨基酸；4個(gè)被完全切除，剩余的31個(gè)形成了C-肽。C-肽從胰島素原序列的中心分離出來(lái)；兩個(gè)其他端部（B鏈和A鏈）通過(guò)二硫鍵保持連接。因此，胰島素原和胰島素是由相同基因編碼的，所以本說(shuō)明書中“胰島素”基因的任何引用都應(yīng)該被理解為指的是編碼胰島素原的基因，以及對(duì)“胰島素原”基因的任何引用均應(yīng)該理解為指的是編碼最終成為胰島素的蛋白的基因。

本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)著手開發(fā)一種優(yōu)選以葡萄糖響應(yīng)的方式上調(diào)靶基因以生成能夠生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞，即生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞在本說(shuō)明書中有時(shí)會(huì)被稱為“特化的”細(xì)胞。本說(shuō)明書中對(duì)于“特化的細(xì)胞”的任何引用優(yōu)選為“生產(chǎn)/能夠生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞”。

目前上調(diào)感興趣的基因表達(dá)的方法要求向細(xì)胞中引入額外拷貝的基因，可以通過(guò)使用病毒以將額外拷貝的基因引入到宿主基因組，也可以通過(guò)引入表達(dá)額外拷貝靶基因的質(zhì)粒。因此，為了上調(diào)，目前需要將表達(dá)載體侵入性瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞中，這引起了安全上的問(wèn)題。目前的方法通常涉及非瞬時(shí)應(yīng)用上調(diào)試劑。這些方法的限制是效果是相類似地非瞬時(shí)的。

RNA干擾(RNAi)是一種重要的基因調(diào)節(jié)機(jī)制，會(huì)引起靶mRNA的序列特異性下調(diào)。RNAi通過(guò)“干擾RNA”(iRNA)介導(dǎo)；這是一個(gè)總稱，包括多種在RNAi過(guò)程中發(fā)揮作用的短的雙鏈RNA(dsRNA)分子。

外源性dsRNA可以通過(guò)核糖核酸酶蛋白Dicer處理成19-25個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選為21-23個(gè)堿基對(duì)的雙鏈片段，在每個(gè)3'末端有幾個(gè)未配對(duì)的堿基形成3'突出。優(yōu)選地，每個(gè)3'突出為1-3個(gè)，更優(yōu)選為2個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。這些短的雙鏈片段稱為小干擾RNA(siRNA)，這些分子使得靶基因的表達(dá)下調(diào)。