[發明專利]3-D目的基因組區域的測序策略

有效

• 申請號: 201180034117.6
• 申請日: 2011-07-08
• 公開（公告）號: CN103180459B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發明（設計）人: 馬克斯·簡·梵閔;沃特·倫納德·德拉特
• 申請（專利權）人: 賽爾冉迪思股份有限公司;荷蘭皇家科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 劉成春;張晶

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及DNA技術。本發明更詳細地涉及DNA測序。本發明涉及測定目的基因組區域的（部分）DNA序列的策略。具體地，本發明涉及測定互為立體構型的基因組部分的序列。本發明進一步涉及本發明方法在研發個性化診斷和醫療、篩選存在惡性腫瘤和其他病癥的組織中的應用。

背景技術

已投入相當大的努力來研發用于測序的“靶向富集”策略，其中選擇性捕獲和/或選擇性擴增DNA樣品中基因組區域，隨后進行測序（綜述于Mamanova等,自然方法(Nature?Methods),2010,(2):111-118）?；蚪M富集策略很重要，因為與全基因組分析相比，它們可以集中關注于特定基因組區域，其更具有時間和成本效益，并且分析難度更小。存在不同的基因組富集策略。例如，利用單個引物對進行PCR反應可擴增基因組區域，并因此富集基因組區域。然而，可產生的PCR產物的大小是有限的。目前可擴增的長PCR方案的上限是10-40kB（Cheng等,Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A,1994;91(12):5695-5699），但這些方法易于缺少穩定性，每個PCR都需要優化和驗證，并且大小限度仍然有限。為了增加可擴增區域的大小和分析的穩定性，開發了使用特別針對目的基因組區域設計的多個PCR引物對的平鋪方法(tiled?approaches)。這些引物可用于例如多重PCR方法或RainDance?PCR。各種酶方法（例如靶向環化）與該靶向擴增策略相匹配。其他方法涉及在陣列上或溶液中應用捕獲探針，其中60-120bp長度的探針用于通過雜交捕獲目的基因組區域。

上述實例明確地表明，為了富集目的基因組區域，前提是需要整個目的基因組區域的序列信息，因為需要用其設計探針和/或引物以捕獲和/或擴增目的基因組區域。例如，為了富集30Mb序列，通常需要6000個單獨的PCR。對于捕獲探針，甚至需要更多的序列信息，因為至少需要多達250,000個120bp的探針并必須進行設計以捕獲30Mb序列。通過使用覆蓋大部分目的基因組區域的探針和/或引物的序列數據，這些分析是有偏倚的。它們不會選取與設計的模板序列偏離太多的序列，從而不會檢測例如插入。另外，通常這些方法需要在分析前將DNA分段成一些100bp的序列。這意味著將目的基因組區域破碎成多段，造成信息丟失，尤其是(a.o.)關于目的區域內的重排。因此，需要偏倚更少的改進的基因組富集策略，其不需要幾千個短序列并使中性假說能夠完成目的區域的測序。

在哺乳動物核結構研究中，已開發了染色體構象捕獲（3C/4C）分析法，用它可以分析基因組區域的結構組織（WO2007/004057，WO2008/08845）。這些技術涉及體內細胞交聯（例如用甲醛），從而將包括DNA的染色質結構固定在其三維結構中。下一步，將染色質分段，例如使用限制性內切酶，隨后連接交聯的DNA片段。結果是連接相互接近的DNA片段。隨后PCR擴增連接產物并分析連接的DNA片段的相互作用頻率，其可表示片段的接近性。PCR擴增可基于目的基因組區域內的靶序列。與目的基因組的高頻率相互作用表示接近的距離近，低頻率相互作用表示接近的距離遠。為了鑒定DNA片段，需要序列信息。該序列信息可通過用微陣列（包括探針）檢測擴增的片段或通過對擴增片段的一小部分（通常，最少20-30bp足以鑒定基因組的相應位置）進行測序來提供。在任何情況下，鑒定的DNA片段的數量，即相互作用頻率，表示片段與觀察點的接近性，此信息可用于測定染色體內和染色體間的相互作用。

發明概述