[發(fā)明專利]3-D目的基因組區(qū)域的測序策略

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201180034117.6
• 申請(qǐng)日: 2011-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN103180459B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬克斯·簡·梵閔;沃特·倫納德·德拉特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賽爾冉迪思股份有限公司;荷蘭皇家科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 劉成春;張晶

1.測定包括靶核苷酸序列的目的基因組區(qū)域的序列的方法，包括將交聯(lián)的DNA分段，連接分段的交聯(lián)DNA，解除交聯(lián)并測定包括所述靶核苷酸序列的連接的DNA片段的至少部分序列，用測定的序列建立目的基因組區(qū)域的序列。

2.測定包括靶核苷酸序列的目的基因組區(qū)域的序列的方法，包括以下步驟：

a）提供交聯(lián)的DNA樣品；

b）將所述交聯(lián)的DNA分段；

c）連接分段的交聯(lián)DNA；

d）解除交聯(lián)；

e）任選地將步驟d）的DNA分段，優(yōu)選地用限制性內(nèi)切酶分段；

f）任選地，將步驟d）或e）的分段的DNA與至少一個(gè)接頭連接；

g）任選地和優(yōu)選地，用至少一個(gè)與所述靶核苷酸序列雜交的引物擴(kuò)增步驟d）或e）的包括所述靶核苷酸序列的連接的DNA片段，或用至少一個(gè)與所述靶核苷酸序列雜交的引物和至少一個(gè)與至少一個(gè)接頭雜交的引物擴(kuò)增步驟f）的連接的DNA片段；

h）測定步驟d）、e）、f）或g）的包括所述靶核苷酸序列的所述（擴(kuò)增的）連接的DNA片段的至少部分序列，優(yōu)選地用高通量進(jìn)行測序；

i）從測定的序列中建立目的基因組區(qū)域的重疊群。

3.測定包括靶核苷酸序列的目的基因組區(qū)域的序列的方法，包括以下步驟：

a）提供交聯(lián)的DNA樣品；

b）將所述交聯(lián)的DNA分段；

c）連接分段的交聯(lián)DNA；

d）解除交聯(lián)；

e）任選地將步驟d）的DNA分段，優(yōu)選地用限制性內(nèi)切酶分段；

f）將步驟d）或e）的DNA環(huán)化；

g）任選地和優(yōu)選地，用優(yōu)選的至少一個(gè)與所述靶核苷酸序列雜交的引物擴(kuò)增包括所述靶核苷酸序列的環(huán)化的DNA；

h）用高通量測序測定包括所述靶核苷酸序列的所述（擴(kuò)增的）連接的DNA片段的至少部分序列；

i）從測定的序列中建立目的基因組區(qū)域的重疊群。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的測定目的基因組區(qū)域的序列的方法，其中所述目的基因組區(qū)域包括另外的一個(gè)或多個(gè)靶核苷酸序列，其中在擴(kuò)增步驟（g）中提供與所述靶核苷酸序列雜交的引物以及提供與一個(gè)或多個(gè)另外的靶核苷酸對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)引物，其中用所述引物擴(kuò)增連接的DNA片段或擴(kuò)增環(huán)化的DNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4所述的方法，其中分段步驟b）包括聲波降解，隨后是酶法DNA末端修復(fù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求2-4所述的方法，其中分段步驟b）包括用限制性內(nèi)切酶分段。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中連接步驟c）在接頭存在下進(jìn)行，將接頭序列連接于片段之間。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中在步驟b）中處理大量子樣品，對(duì)于每個(gè)子樣品，使用具有不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中分段步驟e）包括限制性內(nèi)切酶，其具有比步驟b）的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列更長的識(shí)別序列。

10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測定多個(gè)目的基因組區(qū)域的序列。

11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中步驟g）的至少一個(gè)寡核苷酸引物中包含標(biāo)識(shí)。

12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中在擴(kuò)增步驟g）之前或之后，進(jìn)行大小選擇步驟。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用凝膠提取色譜、凝膠電泳或密度梯度離心進(jìn)行所述大小選擇步驟。

14.根據(jù)權(quán)利要求12-13所述的方法，其中選擇大小在20-200000bp之間，優(yōu)選地50-100000bp，更有選地在100-3000bp之間的DNA。

15.根據(jù)權(quán)利要求1-14所述的方法，其中如果細(xì)胞中目的基因組區(qū)域的倍性大于1，在步驟i）中為每個(gè)倍性建立重疊群。

16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中建立重疊群的步驟i）包括以下步驟：

1）鑒定步驟b）的片段；

2）將片段分配至基因組區(qū)域；

3）為基因組區(qū)域建立重疊群。