[發明專利]用于確定LRRK2抑制劑的試驗

無效

• 申請號: 201180030200.6
• 申請日: 2011-04-19
• 公開（公告）號: CN102947339A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: D·阿萊西;R·J·尼克爾斯;N·澤姆科
• 申請（專利權）人: 醫學研究理事會
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C12N9/12;G01N33/573;C12Q1/48;G01N33/68
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

本發明涉及用于評估LRRK2抑制劑的試驗。

編碼富亮氨酸重復序列蛋白激酶-2（LRRK2）的基因中的常染色體顯性錯義突變使人類易于患帕金森氏病[1,2]。LRRK2突變的患者通常患有帕金森氏病，其臨床表現和癥狀不易區分于60-70歲左右的自發性帕金森氏病[3]。LRRK2突變占家族性帕金森氏病的4％，并在1%的散發性帕金森氏病患者中觀察到LRRK2突變[3]。

LRRK2是一種較大的酶（2527個殘基），其由富亮氨酸重復序列（殘基1010-1287）、GTP酶結構域（殘基1335-1504）、COR結構域（殘基1517-1843）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域（殘基1875-2132）和WD40重復序列（殘基2231-2276）構成[4]。已報導了超過40種錯義突變[5]。在之前的工作中，已使用各種類型的重組LRRK2對LRRK2的突變型亞群的活性以及定位進行分析，所述的各種類型的重組LRRK2使用多種方法表達和測定[4,32]。最常見的突變包括位于激酶結構域的亞結構域VII-DFG基序的高度保守的Gly2019進行氨基酸取代成Ser殘基[5]，使LRRK2的蛋白激酶活性提高約2倍[6]。該發現表明LRRK2的抑制劑可用于治療帕金森氏病。也報導了在分散的細胞溶質池中蓄積的各種突變體如LRRK2[R1441C]和LRRK2[Y1699C]，認為其由錯誤折疊的蛋白聚集體構成[6]。

在采用肽底物如LRRKtide[7]或Nictide[8]的試驗中，可容易地在體外測定LRRK2固有的蛋白激酶催化活性；這還參見WO?2008/122789和PCT/GB2009/002047。這使得有可能進行篩選以確定抑制劑。最近的工作表明廣泛分布的稱為H-1152的Rho-激酶（ROCK）抑制劑也以相似的效價抑制LRRK2（IC₅₀為150nM）[8]。用于治療腎細胞癌和其它癌癥的多靶點酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼（商品名索坦，也稱為SU11248）最近被證實可抑制LRRK2（IC₅₀為20nM）[8-10]。我們還發現H-1152和舒尼替尼對LRRK2[G2019S]突變體的抑制比野生型LRRK2強兩到四倍[8]。根據LRRK2激酶結構域的分子模擬，我們設計了耐藥性LRRK2[Ala2016Thr]突變體，其具有正常活性，但對H-1152的敏感度降低32倍，對舒尼替尼的敏感度降低12倍[8]。

由于對于LRRK2是如何被調節的以及其底物是什么了解甚少，因此開發LRRK2抑制劑的瓶頸是如何評估這些化合物在體內的相對有效性。我們提供了可用于在基于細胞的系統中評估的LRRK2抑制劑的方法。我們證明了LRRK2激酶活性調節鄰近富亮氨酸重復序列結構域的兩個N-端殘基（Ser910和Ser935）的磷酸化，所述的磷酸化介導與磷適體14-3-3蛋白的結合[11]。與此一致的是，H-1152和舒尼替尼誘導Ser910和Ser935的去磷酸化，從而破壞14-3-3與野生型LRRK2和LRRK2[G2019S]的相互作用，但未破壞其與耐藥性LRRK2[Ala2016Thr]突變體的相互作用。我們提供的證據表明破壞14-3-3的結合誘導LRRK2在胞質池中蓄積，這表現為與之前報導的LRRK2[R1441C]和LRRK2[Y1699C]突變體的胞質池相似。Ser910和Ser935的磷酸化或14-3-3結合，或LRRK2的亞細胞定位，可用于監測LRRK2抑制劑的效果。

本發明的第一個方面提供了用于評估試驗化合物在基于細胞的系統中對LRRK2的作用的方法，所述方法包括步驟：

a）評估將含有LRRK2的基于細胞的系統暴露于試驗化合物對LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化狀態的作用；和/或

b）評估將含有LRRK2的基于細胞的系統暴露于試驗化合物對LRRK2與14-3-3多肽結合的作用。

在某些實施方案中，該方法可包括或進一步包括評估將含有LRRK2的基于細胞的系統暴露于試驗化合物中對LRRK2的亞細胞定位的作用的步驟。

所述方法可進一步包括選擇認為對基于細胞的系統中的LRRK2具有抑制作用的化合物的步驟，其中如果LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化在暴露后降低；和/或LRRK2與14-3-3多肽的結合在暴露后降低，則選擇該試驗化合物。