[發明專利]用于增強基因表達的新型基因間元件

有效

• 申請號: 201180029783.0
• 申請日: 2011-06-15
• 公開（公告）號: CN103038352A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: A·P·奧特;M·西普;J·A·沃赫斯;F·霍克薩馬;H·J·M·范布洛克蘭德
• 申請（專利權）人: 薩拉基尼克有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/67
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 王鳳桐;周建秋

技術領域

本發明涉及分子生物學和生物技術領域。更具體而言，本發明涉及一種改進篩選具有高表達水平的宿主細胞的手段和方法。

背景技術

生物活性蛋白在各種宿主細胞中產生，從細菌和酵母菌到哺乳動物細胞。當蛋白質需要某種翻譯后修飾如糖基化以發揮適當功能時，優選以哺乳動物細胞作為宿主細胞。通常，在哺乳動物細胞中產生的蛋白質由編碼目的蛋白的所謂的“轉基因”表達。為確保篩選出正確的產生蛋白質的細胞，將編碼目的基因的轉基因和編碼可篩選標記的第二轉基因相偶聯，通常它們位于相同的載體上。當將篩選試劑添加到已經含有轉基因的質粒轉染的細胞培養物中時，只有那些含有可篩選標記的細胞能夠存活下來。常見的問題是篩選的嚴格性很低。這就意味著該細胞不得不僅產生很少量的選定蛋白以保證能夠在存在毒性篩選劑的條件下存活。尤其當可篩選標記是用來中和毒性篩選劑的酶時，就會發生這些問題。一個酶分子在一段時間內能夠中和許多分子的篩選劑。這種組合的實例是新霉素和氨基糖苷磷酸轉移酶（新霉素）可篩選標記。可篩選標記蛋白的限制性需求還限制了轉基因蛋白質的表達水平。例如，可篩選標記的低表達水平可以通過僅引入幾個拷貝的質粒來實現。然而，這也意味著僅有幾個基因拷貝能夠用于表達轉基因蛋白，因而導致轉基因蛋白的表達水平很低。因此，低篩選嚴格性通常伴隨著目的蛋白的低表達水平。這顯然是低篩選嚴格性帶來的不良負面影響。

當使用博萊霉素和博萊霉素可篩選標記時，能夠看到篩選嚴格性的改善。博萊霉素篩選蛋白質是一種以非酶方式起作用的可篩選標記蛋白。按化學計量它與兩個博萊霉素篩選分子結合，但不進一步加工這些分子。因此，可用的博萊霉素篩選蛋白僅具有有限的能力來中和一定量的添加到培養基中的博萊霉素分子。因此，該細胞必須產生比（例如）新霉素可篩選標記mRNA多得多的博萊霉素可篩選標記，以便產生足夠的篩選蛋白來分別中和博萊霉素或新霉素。當與目的基因偶聯時，通常還產生較高水平的編碼目的基因產物的mRNA。這些較高水平的mRNA意味著目的基因產物的較高表達。

在篩選穩定轉染的克隆時僅能針對用于可篩選標記的表達進行篩選，而不能針對目的基因的表達進行篩選。鑒于此，優選的是目的基因的表達和可篩選標記的表達水平有直接的聯系。有多種方法使得目的基因和編碼可篩選標記基因的基因以物理的方式相偶聯。可以將內部核糖體進入位點（InternalRibosome?Entry?Site，IRES）序列置于目的基因和編碼可篩選標記的基因之間。這就產生了雙順反子mRNA，從雙順反子mRNA上目的基因產物和篩選蛋白均被翻譯（Rees?et?al.,1996,Biotechniques?20:102-110）。當需要大量的篩選蛋白例如博萊霉素篩選蛋白使得細胞存活下來時，需要高水平的雙順反子mRNA。這就意味著編碼目的基因產物的高水平的mRNA能夠隨時用于翻譯，因而獲得了目的基因產物相對高的表達水平。與目的基因和編碼可篩選標記的基因未通過IRES序列相結合時相比，這個原理提供了較高的篩選嚴格性。這一篩選相對高水平表達目的基因產物細胞克隆的過程是已被接受和經常使用的方法（參見例如WO?03/106684、WO?2006/005718和WO2007/096399）。

使篩選嚴格性達到較高水平的其他方法是使用具有能夠減弱但不會完全破壞可篩選標記活性的突變的可篩選標記。為了中和培養基中的相似量的毒性篩選分子，必須產生比野生型篩選蛋白更加突變和更加受損的篩選蛋白。當通過IRES序列與目的基因相偶聯時，較高受損的篩選標記mRNA水平確保了存在更多可用于翻譯的目的基因的mRNA（參見例如WO?01/32901和WO?2006/048459）。