[發明專利]用于增強基因表達的新型基因間元件

有效

• 申請號: 201180029783.0
• 申請日: 2011-06-15
• 公開（公告）號: CN103038352A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: A·P·奧特;M·西普;J·A·沃赫斯;F·霍克薩馬;H·J·M·范布洛克蘭德
• 申請（專利權）人: 薩拉基尼克有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/67
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 王鳳桐;周建秋

1.一種核酸片段，該核酸片段包括：

a）位于脊椎動物Rb1基因的翻譯起始位點上游的基因組區域的1000至15000個連續核苷酸；或，

b）位于脊椎動物p15基因的翻譯起始位點上游10.5至7千堿基位置的基因組區域的至少1500個連續核苷酸；

其中，在實施例1的條件下進行測試，所述片段當與具有SEQ?ID?NO:9的核苷酸序列的表達盒直接在表達盒的上游位置和下游位置側面連接時，與在表達盒的上游側面連接STAR?7和STAR?67且在表達盒的下游側面連接STAR?7的相同表達盒（SEQ?ID?NO:10）相比，至少產生50%的克隆數。

2.根據權利要求1所述的核酸片段，其中，所述片段的全長與SEQ?IDNO:1-4或8中的至少一個的至少1000個連續核苷酸具有至少80%的核苷酸序列同一性。

3.根據權利要求1或2所述的核酸片段，其中，所述片段來自人、小鼠、大鼠、倉鼠、牛、雞、犬、豚鼠、豬或兔的基因組。

4.根據權利要求1-3中任意一項所述的核酸片段，其中，所述核酸片段的全長與含有下列核苷酸殘基的片段具有至少80%的核苷酸序列同一性：

a）SEQ?ID?NO:5的1-1019、1-1482、1-2018、1-3498、479-2018或479-1482的核苷酸殘基；

b）SEQ?ID?NO:6的1-2448、1-3424或2425-3424的核苷酸殘基；

c）SEQ?ID?NO:7的1-3064、1-2500或1-2000的核苷酸殘基；和

d）SEQ?ID?NO:8的1-1500、822-3352或1-3352的核苷酸殘基。

5.一種核酸構建體，該核酸構建體含有根據權利要求1-4中任意一項所述的核酸片段，其中，所述片段至少和一個核苷酸連接，所述核苷酸在所述片段來源的基因組中不直接與所述片段發生天然連接。

6.根據權利要求5所述的核酸構建體，其中，所述核酸片段連接有表達盒，所述表達盒含有與編碼目的基因產物的核苷酸序列可操作地連接的啟動子。

7.根據權利要求6所述的核酸構建體，其中，所述構建體含有位于所述表達盒上游和下游的根據權利要求1-4中任意一所述的核酸片段。

8.根據權利要求7所述的核酸構建體，其中，表達盒上游的核酸片段和表達盒下游的核酸片段不同。

9.根據權利要求6-8中任意一項所述的核酸構建體，其中，所述表達盒進一步含有在真核宿主細胞中具有功能的編碼可篩選標記的核苷酸序列。

10.根據權利要求9所述的核酸構建體，其中，所述可篩選標記能夠提供對篩選劑的致死效應或生長抑制效應的抗性，所述篩選劑選自以下組成的組中：博萊霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟素、潮霉素、新霉素、氨甲蝶呤、氨基亞砜蛋氨酸和卡那霉素。

11.根據權利要求9或10所述的核酸構建體，其中，所述編碼可篩選標記的核苷酸序列至少是下列核苷酸序列其中之一：

a）在起始密碼子中具有突變的核苷酸序列，該突變能夠降低可篩選標記多肽在真核宿主細胞中的翻譯起始效率；

b）作為多順反子轉錄單元一部分的核苷酸序列，所述多順反子轉錄單元含有：i）編碼可篩選標記的核苷酸序列；和ii）含有在5′至3′方向上的翻譯起始密碼子、至少一個氨基酸密碼子和翻譯終止密碼子的功能性開放讀碼框；其中所述功能性開放讀碼框的終止密碼子位于編碼可篩選標記的核苷酸序列的獨立翻譯起始密碼子的上游的0-250個核苷酸處，其中分隔功能性開放讀碼框的終止密碼子和編碼可篩選標記的核苷酸序列的獨立翻譯起始密碼子的序列缺乏翻譯起始密碼子；以及

c）含有突變的編碼可篩選標記多肽的核苷酸序列，該突變編碼至少一個氨基酸置換，與其相應的野生型相比，可篩選標記多肽的活性降低。

12.根據權利要求9-11中任意一項所述的核酸構建體，其中，編碼可篩選標記的核苷酸序列和編碼目的基因產物的核苷酸序列存在于單個多順反子轉錄單元中，其中所述多順反子轉錄單元與啟動子和位于多順反子轉錄單元下游的轉錄終止序列可操作地連接。