[發明專利]綴合的凝血因子VIII

在審

• 申請號: 201180021888.1
• 申請日: 2011-04-28
• 公開（公告）號: CN102939108A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: W·亨利
• 申請（專利權）人: 劍橋生物制藥專利有限公司
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61P7/04;A61K38/37
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 王鳳桐;周建秋

技術領域

本發明涉及綴合形式的凝血因子VIII。

背景技術

因子VIII(FVIII)是必不可少的凝血因子，也被稱為抗血友病因子(AHF)。對人類而言，因子VIII由F8基因編碼。在該基因上的缺陷會導致血友病A，這是一種眾所周知的隱性X染色體連鎖的凝血異常，影響著大約1/5000的男性。

X染色體連鎖的F8基因編碼來自26個外顯子的具有2351個氨基酸的多肽，該多肽在被切割了信號肽之后形成具有2332個氨基酸的成熟FVIII分子(Wang?et?al.Int.J.Pharmaceutics,259:1-15(2003))。已經發現FVIII被合成并通過肝臟的血管細胞、血管小球細胞（glomerular?cells）、管狀內皮細胞（tubular?endothelium?cells）和竇內皮細胞（sinusoidal?cells）釋放到血液中，但是人體內FVIII的初始釋放位點在哪里仍然存在很大爭議。FVIII分子由六個蛋白結構域組成；NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。成熟的分子含有許多翻譯后修飾，包括N-連接和O-連接的糖基化，磺基化以及二硫鍵的形成。FVIII總共含有23個半胱氨酸殘基，其中16個半胱氨酸殘基在蛋白質的A和C結構域中形成了8個二硫鍵(McMullen?et?al.Protein?Science,4:740-746(1995))。由于蛋白質的翻譯后修飾，基于糖基化的水平和類型，它的循環分子量（circulation?molecular?weight）能夠多達330kDa。FVIII也會經歷蛋白水解過程，從而使得血液循環中的種類是由重鏈(A1-A2-B)和輕鏈(A3-C1-C2)組成的異二聚體。當FVIII被分泌進入血液循環時，它以非共價的形式與血管性血友病因子(von?Willebrand?Factor，vWF)結合。兩個分子的結合涉及FVIII的輕鏈的A3和C2結構域(Lacroix-Desmazes?et?al.Blood,112:240-249(2008))。與vWF的結合增加了FVIII的穩定性和循環半衰期（circulatinghalf-life）。雖然與vWF的結合能夠增加FVIII的循環半衰期，它的天然半衰期僅為15-19小時。

因子VIII是參與內源性凝血途徑必不可少的輔因子。在凝血級聯反應中它的作用是作為“成核模板”，以使得FX酶復合物的組分在活化的血小板的表面以正確的空間方向有機排布(Shen?et?al.Blood,111:1240-1247(2008))。FVIII首先由凝血酶(因子Ⅱa)或者FXa活化，然后它以FVIIIa的形式從vWF解離。然后，FVIIIa在血管損傷的位置與活化的血小板結合，并通過A2和A3介導的相互作用與FIXa結合。當血小板表面存在Ca²⁺離子時，FIXa與FVIII的結合使得FIXa的蛋白水解活性增加了大約200000倍。然后，該復合物將FX活化為FXa。然后因子Xa和它的輔因子因子Va活化更多的凝血酶。凝血酶轉而將纖維蛋白原切割為纖維蛋白，然后纖維蛋白聚合并交聯(利用因子XIII)成為纖維蛋白血塊。

由于不再受vWF的保護，在過程中活化的FVIII被蛋白水解而失活(最主要是通過活化的蛋白質C和因子IXa)并迅速從血流中被清除。

蛋白質聚乙二醇化方法已由PolyTherics有限公司開發，并被稱為TheraPEG^TM，在該產品中，通過蛋白質中的一對半胱氨酸殘基的還原型二硫鍵，PEG聚合物與目的蛋白相連接(WO?2005/007197)。這一技術已被用于制備無因子FIXa污染的因子IX的聚乙二醇化變體(WO?2009/130602)。

然而，對于使用同樣的技術制備聚乙二醇化的FVIII而言，則被認為是重要的或者非常規的。

從活性角度來看，FVIII與FIX存在某些關鍵的區別，這就意味著這種蛋白質和生物相容性聚合物的綴合并不是一個簡單的步驟。

例如，FIXa是一種絲氨酸蛋白酶，而FVIII則沒有酶活性。一旦活化，FIX僅需要與它的輔因子形成結合，而FVIII則需要參與凝血級聯反應。

而且，FVIII是輔因子，且能夠形成“模板”，其它凝血因子(包括FIXa)組裝在該“模板”上從而增強它們的催化活性。