[發明專利]生物標記物成像期間增加可檢測光子數目的方法

有效

• 申請號: 201180021806.3
• 申請日: 2011-03-25
• 公開（公告）號: CN102869983A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: K·羅杰斯;S·L·肖特;J·德拉加翁;S·布拉茲凱
• 申請（專利權）人: 巴斯德研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;B82Y15/00
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及一種新的使來自生物標記物的光信號紅移的方法。尤其本發明涉及發光的生物標記物和熒光團之間的激發機制。本專利申請還涉及用于實施根據本發明方法的試劑盒以及未結合的熒光團產生光子的用途，與生物標記物產生的光子相比，未結合的熒光團產生光子為紅移的。

背景技術

產生光信號的生物標記物的用途已經改革了生命科學的多個方面，特別是其允許實時觀察體內如內吞作用、胚胎發育、感染、腫瘤發展和鈣信號的現象。越來越多地，此類相同的技術還被用于使更多的生物和藥學過程在靶細胞、分離的組織或整個生物體中原位可視化。

實質上有三個用于使用生物標記物產生基于光信號的光發射的機制：

1、生物發光。

2、化學發光。

3、熒光。

生物發光是由活生物體或其片段如酶產生和發射光。生物發光是化學發光（見下文）的天然發生的形式，其中能量通過化學反應以光發射的形式釋放。在大多數生物發光反應中涉及三磷酸腺苷（ATP），因而通常生物發光反應發生在體內。

化學發光是化學反應產生的光的發射。其不同于生物發光，因為化學反應的成分沒有必要發生在體內。

熒光是由吸收不同波長輻射的物質的光發射。在大多數情況下，某一波長的光的吸收誘導具有更長波長的光的發射。熒光分子通常稱為熒光團，在激發后光的發射中不涉及化學反應。

以生物發光為例，已經用編碼生物發光探針（如水母發光蛋白（aequorin）或各種熒光素酶）的基因進行遺傳修飾的生物體的使用，允許在活生物體或小動物模型中使得許多生物過程非侵入地可視化（1-3）。生物發光成像是高度敏感的，理由在于由于哺乳動物組織的非常低水平的內在生物發光，在完整生物體如小鼠中，信號可被視覺檢測（4）。生物發光探針，如水母發光蛋白（5、6）或酶熒光素酶（細菌、螢火蟲、海螢（Cypridina）（7）或海腎（Renilla）（8））已被整合到宿主細胞或病原體中用于生物發光成像。這些工具已被應用于范圍從感染和腫瘤發展到鈣信號的研究。然而，這些生物標記物的大多數在色譜的藍—綠—黃（400-650nm）區域內發射光（9），其與哺乳動物組織的主要吸收譜重疊，特別地與氧合血紅蛋白、脫氧合血紅蛋白和黑色素的吸收譜重疊，從而降低了檢測效力（1、10）。由于這些吸收物的存在，體內光學成像中的主要挑戰是通過開發近紅外（NIR）紅譜（650-900nm）發射光的光學探針，實現更高水平的靈敏度，在活哺乳動物組織中，該光僅被微弱吸收。

即使有這些缺點，該技術的使用其自身已便于應用于涉及比如麻醉的和非麻醉/清醒的小嚙齒動物的實驗中（21）。如上所述，在小嚙齒動物模型中（以及更通常地在哺乳動物中），容易在色譜的藍—黃區域中被吸收的各種血紅蛋白和組織的存在降低了激發和檢測熒光團的能力，或者如果其在相同譜中，降低了監測由修飾的細胞和細菌產生的發光信號的能力。

改善來自生物發光源的可檢測光子的數目的顯著努力導致開發了大量新的和/或改善的生物發光探針以及增加在色譜紅區域（>650nm）發射光子的數目的技術。沒有證實由于太難而不能夠設計在近紅外（NIR）-紅區即能激發又能發射的熒光團或熒光蛋白（22）。

但是，已經證實，為了實現生物發光發射的相似紅移更加困難。一種建立所需紅移的方法已經開發能夠在光譜NIR紅區部分的這一部分發射的熒光素酶變體。但是，目前為止開發的大多數突變體/突變已經導致在黃—綠區域發射（9），并且僅有幾個成功的紅色生物發光產物的實例（11），而且這樣的NIR紅區工程化的蛋白質通常產生比非工程化黃—綠版本顯著更低的信號。

考慮到產生NIR紅區生物發光的困難，因而顯著的努力已經朝向了創造可用的方法以使用生物發光共振能量轉移（BRET）在發射的光子中產生紅移（13）。一些小組已經證實利用結合至QDs的熒光素酶（8）或其它具有大的斯托克斯位移的熒光團（7）的技術是成功的。

在這些以前的方法中，研究者調查了通過使海腎線蟲（Renilla?reniformis）的八突變變體綴合至量子點的BRET，其中海腎線蟲作為能量供體，量子點（QDs）作為能量受體，從而實現能量轉移后來自QD的在655nm處的發射峰值（8）。更最近地，將生物素化的海螢熒光素酶綴合至遠紅熒光靛青衍生物，在675nm提供了發射峰（7）。但是，在BRET中，供體和受體必需極為貼近（10nm以下（12-15）），因為其涉及從發光供體至受體的非輻射能量轉移。