[發明專利]檢測和/或定量沙門氏菌屬物種的肽核酸探針，試劑盒和方法和其應用

有效

• 申請號: 201180017179.6
• 申請日: 2011-03-29
• 公開（公告）號: CN102939390A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: N·F·里貝羅品托德奧利維拉阿澤維多;M·J·洛佩茲達克斯塔維埃拉;C·M·費爾南德斯阿爾梅達;C·W·齊威爾
• 申請（專利權）人: 米尼奧大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

【技術領域】

本發明涉及檢測與臨床和食品安全性關聯的微生物的方法。為此目的，開發了檢測沙門氏菌屬（Salmonella）的PNA探針。

除了探針之外，本發明包括ONA?FISH方法和其應用于檢測和/或定量沙門氏菌屬（Salmonella?spp.）物種的試劑盒，其可用于食品和臨床領域。

【背景技術】

沙門氏菌屬（Salmonella）包括可導致跨簡單胃腸炎到系統性感染的疾病的幾種病原性細菌。疾病嚴重性通常由沙門氏菌屬（Salmonella）物種/株的毒力，宿主（人或其他動物物種）和宿主健康狀態測定。

屬的種系發生分析顯示了其分為2個物種：乍得沙門氏菌（Salmonella?bongori）和腸沙門氏菌（Salmonella?enterica）。雖然如此，至今已鑒定多于2500種血清型，大多數能感染人和廣范圍的動物物種。沙門氏菌屬（Salmonella）株被常規鑒定，及根據Kauffmann-White血清分型方案分類，其基于外膜中存在的抗原類型。

此細菌可經糞便-口腔途徑或當發生土壤，水和食品的糞便污染時通過與外部貯器直接接觸而直接在人之間傳播。因此開發穩健的檢測方法致使鑒定全部這些樣品類型的細菌變得重要。例如，“Food?and?drug?Administration”旨在通過在家禽飼養場實施對于污染的卵殼的測試程序來控制腸炎沙門氏菌（Salmonella?enteritidis）的傳播，由于卵殼已鑒定為在微生物傳播中重要。

沙門氏菌屬（Salmonella）的檢測傳統上使用培養方法進行。但是，這些方法是艱辛而且耗時（4～6天）和艱辛的過程。像這樣，需要可輔助控制細菌以便減少人和動物中的沙門氏菌病的更快的和更可靠的新方法的開發。為此目的，已開發許多分子檢測方法，以減少鑒定食品，糞便，水和臨床樣品中的沙門氏菌屬（Salmonella）需要的時間。這些方法包括免疫酶測定（ELISA），聚合酶鏈反應（PCR），及FISH。但是，一些研究顯示，基于PCR及ELISA的方法無法檢測一些通過培養方法為陽性的樣品。即便如此，基于PCR的方法被證明為相比ELISA方法更精確。另一方面，當在PCR之前進行選擇性富集步驟，不僅檢測全部培養-陽性樣品，而且通過PCR可檢測未通過培養方法檢測到的沙門氏菌屬（Salmonella）的存在。這些研究揭示，富集步驟可通過消除問題諸如在特定類型的樣品，諸如食品和糞便樣品中低數的細菌和抑制性物質的存在而增加分子檢定靈敏度。但是，基于PCR的方法通常需要DNA提取步驟，而且以上方法均不，除了FISH之外，允許樣品之中細菌的直接可視化。此可為重要，例如，通過允許直接評估樣品中卵殼的沙門氏菌屬（Salmonella）污染。

FISH是廣泛應用于樣品之內細菌鑒定和定位的分子測定。此方法基于小寡核苷酸（探針）與特定rRNA區的特異性結合。探針偶聯于熒光色素，且在雜交之后，熒光信號由于細胞之內的高rRNA拷貝數而可檢測。已有一些研究報道使用DNA探針的沙門氏菌屬（Salmonella）檢測（Kutter等人,2006;Nordentoft等人,1997）。

近來，已開發用于微生物檢測的肽核酸探針（PNA）。這些分子模擬DNA及能遵從Watson-Crick規則與互補核酸特異性雜交。但是，建立的鍵更強，由于，在PNA分子中，其帶負電的糖-磷酸酯主鏈結構被單元中中性重復的（2-氨基乙基）甘氨酸取代。FISH技術中此分子的充足的使用致使過程更穩健，更快和更有效。

對于沙門氏菌屬（Salmonella），已之前開發PNA?FISH方法（Perry-O’Keefe等人,2001）。但是，使用的探針具有與其他物種，諸如伴放線放線桿菌（Actinobacillus?actinomycetemcomitans），蚜蟲巴克納氏菌（Buchnera?aphidicola），流感嗜血桿菌（Haemophilus?influenza）和耶爾森菌屬（Yersinia?spp.）物種互補的序列，使其成為對于診斷欠有吸引力。由此認為，設計及測試新探針及開發用于此特定微生物的新方法是重要的。

重要的是注意到，盡管優化之后非常穩健，PNA?FISH方法的開發就如PCR方法的開發，極其需求及需要涉及的不同參數的化學和物理特征的大量知識。此外，熟知的是，使PNA?FISH方法對生物工作，不保證靶向相同的生物的其他序列會發揮功能。而且，盡管研究者通常感覺對出版陰性結果天然缺乏興趣，幾個研究可見于文獻，其中作者僅能致力于對用于相同的微生物的一些探針工作。