[發明專利]用于靶向遞送siRNA的組合物

在審

• 申請號: 201180010758.8
• 申請日: 2011-02-18
• 公開（公告）號: CN102869774A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: P·海德威格;T·霍夫曼;E·A·基塔斯;D·L·劉易斯;P·莫爾;D·B·羅澤瑪;W·瑟爾;L·C·瓦利斯;D·H·維基菲爾德
• 申請（專利權）人: 箭頭研究公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K31/713;A61K47/18;A61K48/00;C12N15/87
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

將多核苷酸和其他基本不能穿透細胞膜的化合物遞送到活細胞受到細胞復雜膜系統的限制。反義、RNAi和基因治療中使用的藥物是相對高親水性的聚合物，且通常帶較高負電荷。這些物理特征均阻止其直接擴散穿過細胞膜?；诖嗽?，多核苷酸遞送的主要障礙是將多核苷酸遞送穿過細胞膜到達細胞質或細胞核。

一種已經用于體內遞送小核苷酸的方法是將所述核酸與小靶分子或脂質或固醇結合。雖然已在這些偶聯物中觀察到一些遞送和活性，但這些方法需要的核酸劑量非常大。

已開發大量轉染試劑，其能實現體外將多核苷酸相當有效地遞送到細胞。然而，用這些相同轉染試劑體內遞送多核苷酸很復雜且由于體內毒性、血清相互作用和弱靶向而變得無效。體外作用良好的轉染試劑，陽離子聚合物和脂質，通常形成大的靜電顆粒并使細胞膜不穩定。體外轉染試劑的正電荷有助于通過電荷之間（靜電）的相互作用與核酸結合，因此形成核酸/轉染試劑復合物。正電荷還有益于載劑與細胞非特異性結合以及膜融合、去穩定化或破壞。膜的去穩定化有利于充分遞送不能滲透細胞膜的多核苷酸穿過細胞膜。雖然這些特性有利于核酸體外轉移，但它們會造成體內毒性和靶向失效。陽離子電荷與血清組分相互作用，導致多核苷酸轉染試劑相互作用的不穩定和較低的生物利用率和靶向。體外有效的轉染試劑膜活性在體內常導致毒性。

為了體內遞送，載劑（核酸和結合的遞送劑）應較小，直徑低于100nm，優選低于50nm。低于20nm或低于10nm的更小復合物會更有用。大于100nm的遞送載劑體內很少能穿過除了血管細胞之外的細胞。靜電相互作用形成的復合物在暴露于生理鹽濃度或血清組分時傾向于聚集或瓦解。此外，體內遞送載劑上的陽離子電荷導致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高的負電荷還可通過干擾靶向所需的相互作用來抑制體內遞送。因此，體內分布和靶向需要接近中性的載劑。不經過仔細的調控，膜的破壞或去穩定活性在體內使用時有毒。用核酸遞送平衡載劑毒性體外比體內更容易實現。

Rozema等在美國專利公開20040162260中證明了膜活化多胺可逆調控膜破壞活性的方式。所述膜活化多胺提供了破壞細胞膜的方法。pH依賴性可逆調控提供將活性限制在靶細胞內涵體中的方法，以此限制毒性。其方法依賴于含2-丙酸-3-甲基馬來酸酐的多胺上的胺修飾。

該修飾通過伯胺轉變為羧基對（β羧基和γ羧基）將聚陽離子轉變為聚陰離子，可逆地抑制多胺的膜活性。Rozema等(Bioconjugate?Chem.2003,14,51-57)報道了β羧基不表現完全明顯的負電荷且其自身不能抑制膜活性。已報道添加γ羧基基團為有效抑制膜活性所必需。為了共遞送核酸與遞送載劑，所述核酸共價連接所述遞送聚合物。它們能用其生物學上不穩定的偶聯遞送系統將多核苷酸體外遞送到細胞。然而，由于所述載劑帶有高的負電荷，且核酸和修飾的聚合物都具有高負電荷密度，所以此系統對體內遞送無效。所述負電荷可能會抑制細胞特異靶向，通過網狀內皮系統（RES）增加非特異攝取。還使用2-丙酸-3-甲基馬來酸酐修飾的聚合物，Rozema等證明形成了核酸、多聚陽離子和2-丙酸-3-甲基馬來酸酐修飾的聚合物的三重靜電小復合物。

Rozema等在美國專利公開20080152661中通過消除所述經修飾膜活化聚合物的高負電荷濃度改良了美國專利公開20040162260的方法。通過用中性親水靶向基團（半乳糖）和位阻穩定基團（PEG）替代2-丙酸-3-甲基馬來酸酐的γ羧基，Rozema等能保持總體水溶性并可逆抑制膜活性，同時納入有效的體內肝細胞靶向。如前，所述多核苷酸共價連接所述轉染聚合物。通過阻止所述多核苷酸從所述轉染聚合物上解離，保持所述多核苷酸與轉染聚合物的共價結合以確保體內給予期間將所述多核苷酸與轉染聚合物共遞送到所述靶細胞中。需要多核苷酸和轉染聚合物的共遞送，這是由于提供的轉染聚合物用于轉運所述多核苷酸從所述細胞外或內吞區室內穿過細胞膜到細胞質中。美國專利公開20080152661證明了用該新改良生理響應多聚偶聯物將多核苷酸，特別是RNAi寡核苷酸體內高效遞送到肝臟細胞中。

然而，所述核酸與多胺的共價結合本身具有局限性。用于結合核酸和掩蔽劑的轉染聚合物修飾被電荷相互作用復雜化。帶負電核酸與帶正電聚合物的結合傾向于聚集，從而限制了混合物的濃度?？赏ㄟ^添加過量的聚陽離子或聚陰離子來克服聚集。然而，該溶液限制了核酸和聚合物可配制的比率。此外，帶負電核酸結合到未修飾的陽離子聚合物上引起所述復合物的濃縮和聚集，抑制聚合物修飾。所述聚合物的修飾形成陰性聚合物，削弱所述核酸的結合。