[發明專利]3D ADCC NK FACS測定法

有效

• 申請號: 201180008240.0
• 申請日: 2011-02-04
• 公開（公告）號: CN102741695A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: A.查蘭德;C.克萊因;M.庫比斯
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴

本文中報告了一種基于由淋巴瘤細胞和天然殺傷細胞形成的三維球狀體(spheroid)或聚集體的新的抗體依賴性細胞毒性-FACS測定法。此測定法可用于單一及高通量形式的對治療性免疫球蛋白的體外功能分析。

發明背景

已建立的腫瘤細胞系的單層培養物經常在基礎腫瘤生物學研究和抗腫瘤藥物開發中使用。然而，二維的、平坦的培養模型不能充分反映三維(3D)腫瘤構造。因此，涉及溶質擴散梯度的體內形成的特定方面只能在三維培養系統，像例如多細胞腫瘤球狀體或聚集體模型中研究。腫瘤球狀體或聚集體模擬無血管腫瘤區，其特征在于由多細胞層所致擴散屏障引起的有限的營養物供應。

然而，研究中3D培養物的普遍使用受限于不便的生成和操作。因此，開發出一種簡單且快速的方法來以高通量方式生成懸浮培養的單一球狀體或聚集體。具有相等大小和同質球面幾何學的單一球狀體或聚集體可以在24小時培養期內在96孔板的單個孔中生成。它是一種標準化的培養形式，易于化合物操作和球狀體收獲以供隨后分析。一致的大小和幾何學保證在每個球狀體或聚集體中形成幾乎相同的擴散梯度(Ivascu,A.和Kubbies,M.,J.Biomol.Screening?11(2006)922-932)。已知的球狀體生成方案包括添加鼠基底膜提取物(rBM)，即胞外基質蛋白的一種混合物，其誘導聚集體壓縮成球狀體。

Inami,K.等報告了抗C-ERC/間皮蛋白(mesothelin)單克隆抗體的體內抗腫瘤活性(Cancer?Sci.101(2010)969-974)。

發明概述

已經發現了憑借三維球狀體或聚集體中腫瘤細胞和天然殺傷細胞的組合，在一方面，可以使免疫球蛋白的評估更像體內，并且在另一方面，其現在適合于高通量分析。

如本文中報告的第一方面是一種用于在體外檢測抗體的效應器功能的方法，包括將包含腫瘤細胞和天然殺傷細胞的三維球狀體或聚集體與免疫球蛋白一起溫育的步驟。

在一個實施方案中，所述方法包括下列步驟：

a)用第一熒光染料標記腫瘤靶細胞，

b)混合天然殺傷細胞和腫瘤靶細胞，

c)將每200μl約104個細胞添加至多孔板的孔，

d)離心所述多孔板，并且由此啟動三維細胞球狀體的形成，

e)將免疫球蛋白添加至所述多孔板的孔，

f)將所述多孔板溫育約20小時至約72小時，

g)用第二熒光染料標記孔中的死細胞，并

i)通過熒光激活細胞分選(FACS)來分析所述多孔板的孔中的細胞，并且由此檢測所述抗體的效應器功能。

在一個實施方案中，天然殺傷細胞是人天然殺傷細胞，并且具有90%或更多的純度。在又一個實施方案中，天然殺傷細胞和腫瘤靶細胞以10:1至1:10的比率混合。在又一個實施方案中，比率是1:3至1:10的。在另一個實施方案中，比率是1:2至1:4的。在一個實施方案中，離心以100至1,000rpm持續10分鐘。在又一個實施方案中，離心為約1,000rpm。在一個實施方案中，第二熒光染料是碘化丙啶。在一個實施方案中，溫育持續約20小時至約28小時。

在一個實施方案中，腫瘤細胞是淋巴瘤細胞。在另一個實施方案中，淋巴瘤細胞選自下組：Raji細胞、SU-DHL4細胞、和Z138細胞。在另一個實施方案中，以孔中100μg/ml至0.001μg/ml的終濃度添加抗體。在又一個實施方案中，以孔中20μg/ml至0.1μg/ml的終濃度添加抗體。在一個實施方案中，以孔中8μg/ml至12μg/ml的終濃度添加抗體。

如本文中報告的又一方面是包含腫瘤細胞和天然殺傷細胞的三維球狀體或聚集體用于高通量分析眾多抗體和眾多腫瘤細胞的組合的用途。

如本文中報告的另一方面是一種用于在體外確定具有效應器功能的抗體的方法，包括：

a)提供至少一種抗體，

b)用第一熒光染料標記腫瘤細胞，

c)混合天然殺傷細胞和腫瘤靶細胞，

d)將每200μl約10⁴個細胞添加至多孔板的孔，

e)離心所述多孔板，并且由此啟動三維細胞球狀體的形成，

f)將每種提供的抗體添加至所述多孔板的各個孔，

g)將所述多孔板溫育約20小時至約72小時，

h)用第二熒光染料標記每個溫育孔中的死細胞，

i)通過熒光激活細胞分選來分析所述多孔板的每個孔，并