[發明專利]一種降低頭孢菌素C分解的方法

有效

• 申請號: 201110460235.5
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102533920A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 于慧敏;王穎;張婧;羅暉;沈忠耀
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12P35/02
• 分類號: C12P35/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種在采用基因工程菌表達的頭孢菌素C酰化酶催化轉化頭孢菌素C生成7-氨基頭孢烷酸的過程中降低底物CPC分解的方法。

背景技術

頭孢菌素類藥物屬于β-內酰胺類廣譜抗生素，通過干擾細菌細胞壁的合成、加速細胞壁的破壞而起到殺菌的作用。頭孢菌素的抗菌部位為其母核7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic?acid，7-ACA)，它是各類半合成頭孢菌素類抗生素藥物的重要中間體。由于制備工藝簡單、高效、低污染，采用頭孢菌素C(Cephalosporin?C，CPC)酰化酶一步催化裂解CPC生產7-ACA已經成為發展趨勢。

產生CPC酰化酶的天然菌株主要為假單胞菌Pseudomonas?sp.N176(USP5,192,678)和Pseudomonas?sp.SE83?acy?II(Matsuda等.J.Bacteriol.，1987，169：5821-5829)等。由于大腸桿菌的基因工程操作簡便、高效，采用基因工程大腸桿菌為宿主高表達CPC酰化酶的策略目前使用得最為普遍。目前對CPC酰化酶的研究主要集中在對CPC酰化酶的活性提高和產物耐受性改造。對源于P.diminuta?N176的CPC酰化酶的突變研究表明，一種在215位、296位和309位三個位點發生突變的突變體表現出了更高的CPC酶活(Pollegioni?L等.Protein?Science，2005，14(12)：3064～3076)。對源于Pseudomonas?strain?SE83acy?II的CPC酰化酶進行多點耦合突變提高了酶對底物CPC的活性和特異性，CPC酰化酶酶活相對于野生菌提高8～10倍左右(WO?2005/014821A1)。對底物通道處的氨基酸殘基進行突變，可以進一步提高CPC酰化酶的活性(Wang?Y等.Journal?of?Bioscience?and?Bioengineering，2012，doi：10.1016/j.jbiosc.2011.08.027)。重組CPC酰化酶的固定化方法也有公開報道(Zhu?X等.World?Journal?of?Microbiology?and?Biotechnology，2011，27：823-829)。

在應用CPC酰化酶催化CPC生產7-ACA的工業化過程中，從基因工程菌中收獲的CPC酰化酶通常經過簡單純化獲得粗酶液，再進行固定化獲得固定化酶，最后進行CPC催化裂解生成7-ACA的生產過程。研究人員發現，在使用粗酶液催化CPC的過程中，13-15％的底物CPC發生了分解，嚴重降低了原料利用率，增加了生產成本。使用純化的CPC酰化酶可以解決對CPC的分解問題，但由此產生的純化成本顯著增加，不符合工業生產的需要。

發明人從實驗結果和CPC分子的酶分解位點分析出發，發現了CPC酰化酶粗酶中含有的β-內酰胺酶和乙酰基酯酶這兩種雜酶在特定位點對CPC分子產生裂解作用是導致CPC分子降解的主要原因。采用基因工程方法無痕疊加敲除宿主菌中的β-內酰胺酶和乙酰基酯酶基因，獲得雙酶敲除型基因工程菌。采用該工程菌表達CPC酰化酶，收獲的粗酶在催化CPC生成7-ACA過程中，使CPC利用率提高至98％以上。

發明內容

本發明的目的在于提供一種降低頭孢菌素C分解的方法，解決工業酶催化CPC生成7-ACA過程中CPC利用率低的問題。

一種降低頭孢菌素C分解的方法，首先，采用Red重組系統(Datsenko?A?and?Wanner?B，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97(12)：6640-6645)，將宿主菌的β-內酰胺酶和乙酰基酯酶基因敲除，然后將頭孢菌素C酰化酶基因轉化入上述宿主菌，宿主菌表達頭孢菌素C酰化酶，然后采用細胞破碎、離心分離的方法制備頭孢菌素C酰化酶粗酶液，或者采用細胞破碎、離心分離和固定化方法制備固定化頭孢菌素C酰化酶粗酶，將制備的頭孢菌素C酰化酶粗酶液或固定化頭孢菌素C酰化酶粗酶加入到頭孢菌素C底物工作液中催化其生成7-氨基頭孢烷酸。

所述Red重組系統包含3個輔助質粒，分別為攜帶卡那霉素抗性基因的pKD13(GenBank：AY048744)、攜帶Red同源重組酶的pKD46(GenBank：AY048746)和攜帶FLP重組酶的溫敏質粒(CGSC?Collection；Cherepanov?PP?and?Wackernagel?W，Gene.1995，158(1)：9-14)。

所述宿主菌為大腸桿菌或假單胞菌。