[發(fā)明專利]一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110460217.7
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102517300A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 李巖;宮衛(wèi)波;王秋巖;王靜波;胡炎華
• 申請（專利權(quán)）人: 梅花生物科技集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 逯長明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌。

背景技術(shù)

L-蘇氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飼料等，目前L-蘇氨酸主要以微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)，多種細菌可用于L-蘇氨酸生產(chǎn)，如谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌等。由于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸具有繁殖迅速、發(fā)酵溫度高、生理生化基礎(chǔ)研究較深入的優(yōu)勢，逐漸成為L-蘇氨酸生產(chǎn)的常用菌株。

隨著世界對L-蘇氨酸需求量的不斷增加，L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株的研究越來越受到重視。其中，影響大腸桿菌高產(chǎn)的最關(guān)鍵的一個因素就是其耐受L-蘇氨酸的能力，只有解除L-蘇氨酸對代謝途徑的抑制，才能進而增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。雖然野生型的大腸桿菌具有表達L-蘇氨酸耐受蛋白的基因，但該基因所表達的蛋白量較低，僅為大腸桿菌正常生長所需，并不能耐受大于0.1M濃度的L-蘇氨酸，使得野生型的大腸桿菌的產(chǎn)酸能力較低。

因此，利用生物技術(shù)手段對野生型大腸桿菌進行改造，使其能夠具有較高L-蘇氨酸耐受能力，對L-蘇氨酸的生產(chǎn)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌，使得所述大腸桿菌對L-蘇氨酸具有較高的耐受活性。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia?enterocolitica?subsp.enterocolitica?8081菌株的一段蛋白質(zhì)序列，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，NCBI蛋白序號為Gi：123440599，該蛋白具體功能尚未得到公開確認，而經(jīng)申請人研究其具有耐受L-蘇氨酸的活性，但是表達該蛋白的基因來源于同大腸桿菌種屬差異較大的耶爾森氏菌屬，其在大腸桿菌中并不能正確表達該蛋白。故本發(fā)明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性，優(yōu)化密碼子，通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的DNA分子，測序驗證該序列的正確性，合成基因酶切位點為SmaI/HindIII，其中優(yōu)化、合成工作由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。

本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒pKR-D，由質(zhì)粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位點間插入如SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的DNA分子獲得，經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明如SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的DNA分子已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223-3中Sma?I和HindIII酶切位點間，其質(zhì)粒圖譜見圖1。

本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒pKTR-D，其由以下方法制備：

以重組質(zhì)粒pKR-D為模板，用核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示的下游引物擴增，BamHI/SphI雙酶切擴增產(chǎn)物，獲得由Tac啟動子、SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB?T1?Terminator終止子、rrnB?Terminator終止子組成的片段，然后與經(jīng)過BamHI/SphI雙酶切的質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC連接即得；

其中，所述Tac啟動子、rrnB?T1?Terminator終止子位于片段兩端，SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動子、rrnBTerminator終止子之間，rrnB?Terminator終止子位于SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB?T1?Terminator終止子之間。

經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述片段已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位點間，其質(zhì)粒圖譜見圖2。