[發明專利]葡萄球菌腸毒素的二維分子印跡陣列式質量傳感檢測方法

無效

• 申請號: 201110459803.X
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102565161A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉楠;高志賢;馬新華;歐國榮;李曉麗;陳翔
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/333
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測方法，特別是涉及葡萄球菌腸毒素A(SEA)和B(SEB)的檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌是常見的食物中毒致病菌，能引起人和動物多種疾病，其致病性主要與其分泌的腸毒素密切相關。葡萄球菌腸毒素(SEs)是一組耐高熱的低分子量可溶性蛋白，其中SEB是食物中毒的重要致病因子，并被列為生物戰劑的主要毒素之一。SEB蛋白對熱穩定，引起食物中毒的最低濃度是200ng/100g食品，誤食被其污染食品的人在4～6h后引起惡心、嘔吐及腹瀉，因此，研究快速靈敏的檢測SEB和其他多種SEs，如SEA，SEC₁，SEC₂等的方法顯得尤為重要，理想的食品檢測手段對SEB的檢測應該達到ng/mL級，而且樣品不需過多的處理。

目前，SEs的檢測的方法有單、雙向瓊脂擴散法、反向間接血凝法(RPHA)、固相放射免疫法(RIA)和酶聯免疫吸附法(ELISA)等免疫學方法。血清學方法所需的抗體制備工藝繁雜，周期長，效價受到眾多生物因素的影響。RIA、ELISA和RPHA檢測靈敏度雖然可達ng級，但其實驗條件要求苛刻，反應中有假陽性出現等缺點限制了其應用范圍。近年來又發展起來的基因探針檢測方法，由于放射性同位素標記探針的半衰期短及放射污染等缺點限制了該技術的推廣應用。隨著科學技術的發展，出現了分子印跡技術(molecular?imprinting?technique，MIT)，該技術又稱分子烙印(molecular?imprinting)，屬超分子化學中主客體化學范疇，是源于高分子化學、生物化學、材料科學等學科的一門交叉技術。該技術具有特異選擇性的聚合物的過程，當模板分子與聚合物單體接觸時會盡可能地同單體形成多重作用點，如果通過聚合，把這些多重作用點固定或“凍結”下來，當模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子在空間和結合位點上相匹配的具有多重作用點的空穴。獲得的分子印跡聚合物(molecularly?imprinted?polymers，MIPs)具有模擬生物抗體的功能，被形象的稱為“人工抗體”，已成為當今研究的熱點課題之一，其制備過程簡單，成本低廉，物理化學性質穩定，并且具有效預定性、特異識別性和廣泛實用性。但傳統的印跡聚合物是三維塊體，一般密度較大，大分子模板難以達到和離開結合位點，不良的物質傳輸和永久的模板保留對識別性能產生負面影響，再由于常規的非生理性印跡條件和實驗中常用的有機溶劑都會使蛋白變性，使得三維的印跡技術并不適合識別大分子蛋白質。

二維蛋白分子印跡僅使模板蛋白分子印跡在聚合物的表面，印跡位點也處于薄膜的表面，這可克服空間位阻的影響，便于除去模板和蛋白分子接近識別位點，而且使用的溶劑大多數是溫和型和水溶性溶劑，以及生物實驗中常用的緩沖液，可使得靶標蛋白質保持其生理活性和正常的空間結構。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種葡萄球菌腸毒素的二維分子印跡陣列式質量傳感檢測方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種葡萄球菌腸毒素的二維分子印跡陣列式質量傳感檢測方法，包括如下步驟：

(1)石英晶振電極表面活性處理；將三個表面鍍金的石英晶振電極浸入0.05-0.2M的11-巰基醇酸的乙醇溶液中，浸泡8-16h，取出，用無水乙醇沖洗，氮氣吹干，分別標記為A、B和C電極；

(2)初始溶膠凝膠的制備：

將2～3mL原硅酸四乙酯，100～200μl苯基三甲氧基硅烷，100～200μl甲基三甲氧基硅烷，400～600μl濃度為0.05-0.2M的HCl水溶液和2～3ml的H₂O混合，超聲20～30分鐘制備成初始溶膠凝膠；

(3)含有SEA或SEB模板的印跡溶膠凝膠的制備：

取2～4mL初始溶膠凝膠和100～200μl濃度為0.1～0.3mg/mL的SEA磷酸鹽緩沖液，混合均勻，超聲20-40分鐘，獲得含有SEA模板的印跡溶膠凝膠；

取2～4mL初始溶膠凝膠和100～200μl濃度為0.1～0.3mg/mL的SEB磷酸鹽緩沖液，混合均勻，超聲20-40分鐘，獲得含有SEB模板的印跡溶膠凝膠；

(4)對石英晶振電極表面進行涂布處理：