[發明專利]一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201110459137.X
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102559568A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 吳敬;陳晟;段緒果;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/63;C12P19/18;C12P19/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應用，屬于酶工程領域。

背景技術

異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)是一類能夠水解α-1，6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶，該酶能夠水解糖原、支鏈淀粉、α-極限糊精和β-極限糊精，水解產物為線性麥芽寡糖。盡管植物和微生物都能夠產生異淀粉酶，但是由于微生物具有生長迅速、操作簡單及成本低廉等優點，所以商業化的異淀粉酶一般是由微生物生產的。異淀粉酶產生菌株研究的最多的是假單胞菌(Pseudomonas.sp.)，其次是其它細菌和真菌。不同來源的異淀粉酶具有不同的底物特異性、水解產物、最適pH、最適溫度等。異淀粉酶主要用于水解淀粉生產食品添加劑，如高葡萄糖漿、麥芽糖、海藻糖、環糊精和抗性淀粉等。

由于異淀粉酶在淀粉水解中的巨大應用潛力，國內外都對異淀粉酶進行了大量的研究。Harada等研究發現Pseudomonas.sp.來源的異淀粉酶的最適pH在5到6之間。Olemposka-Beer等報道了Pseudomonas?amyloderaosa來源的異淀粉酶最適pH在3到5之間。而芽孢桿菌來源的異淀粉酶的最適pH差異較大，有的最適pH是酸性的在PH?5.0，有的是堿性的pH9.0.酵母來源的異淀粉酶最適pH一般在6.0到7.0。在熱穩定性方面，不同來源的異淀粉酶也有較大差異。酵母來源的異淀粉酶熱穩定性較差，而假單胞菌來源的異淀粉酶一般具有較好的熱穩定性，Yokobayashi等報道了一種來源于假單胞菌的異淀粉酶在45℃具有較好的穩定性，但是當溫度達到60℃時就會迅速失活。工業上淀粉水解過程往往在酸性和較高溫度(50到60℃)下進行。而同時具有在酸性和較高溫度下具有較好活性的異淀粉酶往往更少。目前唯一商業化的異淀粉酶是由日本林原株式會社生產的，其生產菌種是經過誘變改良的Pseudomonas?amyloderaosa，該菌株發酵單位達到5100U/mL。隨著基因工程技術的發展，越來越多的異淀粉酶在大腸桿菌或酵母中得到了成功表達，但是目前發酵水平較低、成本較高，無法達到工業化生產要求。如Chen等將來源于Pseudomonas?amyloderaosa的異淀粉酶編碼基因在釀酒酵母中成功表達，發酵4天酶活達到86U/mL。

環糊精(Cyclodextrins，通常簡稱為CD)，是一類由淀粉或多糖在環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵首尾相連的環狀化合物的總稱，常見的有6、7和8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α-、β-和γ-環糊精。由于α-環糊精溶解度較大，所以化學法制備比較困難，而且會對環境造成較大污染，生物法目前被認為是極具應用潛力的方法。目前生物法生產α-環糊精的工藝一般是采用α-淀粉酶對淀粉進行部分液化，然后加入α-環糊精葡萄糖基轉移酶進行環化反應制備α-環糊精。由于淀粉中原料含有75-85％的支鏈淀粉，支鏈淀粉是高度分支的多糖，其結構中每隔17-28個葡萄糖單位就有一個由α-1，6糖苷鍵構成的分支點。而α-環糊精葡萄糖基轉移酶沒有α-1，6糖苷鍵水解活性，其難以越過α-1，6糖苷鍵，導致周期長、淀粉利用率不高，目前采用這種工藝時α-環糊精轉化率往往在50％左右。

由于淀粉脫支酶能夠切斷淀粉中的分支點，加速后續酶的反應，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，從而增加產量、降低生產成本。Rendleman等報道先采用脫支酶(包括普魯蘭酶和異淀粉酶)對蠟質玉米支鏈淀粉進行脫支，再加入α-環糊精葡萄糖基轉移酶在15℃反應5天，可以使轉化率達到76％。Ivan?Pishtiyski等采用普魯蘭酶對馬鈴薯淀粉、玉米淀粉等進行脫支后再采用酶轉化20小時制備環糊精，發現玉米淀粉濃度為2.5％時轉化率最高，為65％。然而這些工藝存在原料太貴或底物濃度太低，反應周期較長等嚴重問題，因此難以實現工業化生產。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌，是以攜帶重組質粒表達耐熱異淀粉酶基因的大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種構建所述基因工程菌的方法，通過克隆Tfu_1891編碼基因(Genbank登錄號NC_007333.1)到pT7-7載體，以E.coli?BL21(DE3)為表達宿主，實現了酸性耐熱異淀粉酶的高效表達。

所述重組質粒為pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。