[發明專利]一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法

有效

• 申請號: 201110458604.7
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102552896A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 邱貞娜;鄭朝朝;楊保收;郁宏偉;劉濤
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/14;C12M3/00
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;郭紹華

技術領域

本發明涉及一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，尤其涉及一種利用激流灌注式生物反應器生產豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，屬生物技術領域。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病。目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗進行免疫預防，因此，高效價的病毒液是疫苗生產中非常重要的一個環節。

豬繁殖與呼吸綜合征疫苗生產主要是通過轉瓶培養細胞，進而增殖豬繁殖與呼吸綜合征病毒。生產中細胞及病毒培養條件難以控制，導致細胞和疫苗質量不穩定，產品批間差異大，而且自動化程度低，勞動強度大，極大的限制了疫苗的質量與產量。

隨著生物技術的飛速發展，傳統的生產方式已難以滿足市場的需求，使用生物反應器不緹是一種很好的選擇。但應用反應器生產疫苗也存在諸多問題：比如因接種的細胞狀態不一、接種方式不科學導致疫苗批次間差異大、產品質量不穩定；因營養供給方式不科學導致細胞營養缺乏、生長不均勻；因細胞種子鏈擴增困難導致細胞再擴大培養難以實現；以及因清洗、滅菌帶來的操作繁瑣、污染幾率增大、耗費能源等，諸多問題難以枚舉。

綜上所述，本領域還需要繼續研發一種適用的培養豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，以進一步提高產品質量，優化生產條件，簡化生產工藝及流程。

發明內容

本發明目的是克服現有技術之缺陷，提供一種利用激流灌注式生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法。

本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。

一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，它利用一個激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器的液體循環系統由蠕動泵、硅膠管、激流袋、灌注袋、有孔硅膠管與紙片載體組成；所述第一蠕動泵通過硅膠管與激流袋、灌注袋連通、且蠕動泵控制流向為由灌注袋到激流袋；所述第二蠕動泵通過硅膠管與激流袋、灌注袋連通、且控制流向為由激流袋到灌注袋；

制備操作按如下步驟進行：

a.制苗用細胞的培養?

將細胞懸液（宿主細胞和細胞生長液）接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（6），使細胞貼附在紙片載體（8）上，設定設備參數，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；

b.病毒接種與培養

當細胞達到最大密度時，排空反應器內液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a所得制苗用細胞；加入細胞維持液，調節設備參數，啟動病毒培養程序，擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；

c.病毒液收獲

收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；

d.?疫苗的制備

將步驟c收獲的病毒液制備疫苗。

上述制備方法，在步驟a中，宿主細胞是經過有限稀釋法克隆純化篩選的Marc-145或者M104細胞。

上述制備方法，在步驟a中，細胞懸液接種采用兩步法，第一步：從灌注袋（6）下部打入細胞懸液，充滿灌注袋（6），靜置吸附1h；第二步：將灌注袋（6）中的液體打出1/4～1/3，再從上部有孔硅膠管（7）內打入細胞懸液，至細胞懸液充滿灌注袋（6），再靜置吸附0.5～1h；細胞接種密度為：每克載體接種0.6～1.5×10⁷個細胞。

上述制備方法，在步驟a中，系統參數設定為：溫度T1：37～37.5℃、T2：42～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：30%～70%，振蕩速度30～50rpm。

上述制備方法，在步驟a中，細胞生長液循環灌注速度隨培養時間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內液體顏色保持基本一致。

上述制備方法，在步驟a中，根據細胞耗糖及時補充細胞生長液和10～20g/L的葡萄糖，當殘糖量低于1g/L時，進行補液。

上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。

上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0.01～0.3MOI，接毒吸附時間為30～45min。

上述制備方法，在步驟b中，設備參數為：溫度T1：36～37℃、T2：39～43℃、T3：35～36℃，pH：7.2～7.6，DO：30%～70%，振蕩速度30～50rpm。

上述制備方法，在步驟b中，接毒后18～20h時需要補充循環系統總體積1/10～1/5的2～5倍濃縮DMEM液和10～20g/L的葡萄糖。