[發明專利]一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法

有效

• 申請號: 201110458604.7
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102552896A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 邱貞娜;鄭朝朝;楊保收;郁宏偉;劉濤
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/14;C12M3/00
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;郭紹華

1.一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，其特征在于，它利用一個激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器的液體循環系統由兩個蠕動泵、硅膠管、激流袋（5）、灌注袋（6）、有孔硅膠管（7）與紙片載體（8）組成；所述第一蠕動泵（1）通過硅膠管（3）與激流袋（5）、灌注袋（6）連通、且蠕動泵（1）控制流向為由灌注袋（6）到激流袋（5）；所述第二蠕動泵（2）通過硅膠管（4）與激流袋（5）、灌注袋（6）連通、且控制流向為由激流袋（5）到灌注袋（6）；

制備按如下步驟進行：

a.?制苗用細胞的培養?

將細胞懸液，內含宿主細胞和細胞生長液，接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（6），使細胞貼附在紙片載體（8）上，設定設備參數，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；?

b.病毒接種與培養

當細胞達到最大密度時，排空反應器內液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a所得制苗用細胞；加入細胞維持液，調節設備參數，啟動病毒培養程序，擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；

c.?病毒液收獲

收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；

d.?疫苗的制備

將步驟c收獲的病毒液制備疫苗。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，宿主細胞是經過有限稀釋法克隆純化篩選的Marc-145或者M104細胞。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細胞懸液接種采用兩步法，第一步：從灌注袋（6）下部打入細胞懸液，充滿灌注袋（6），靜置吸附1h；第二步：將灌注袋（6）中的液體打出1/4～1/3，再從上部有孔硅膠管（7）內打入細胞懸液，至細胞懸液充滿灌注袋（6），再靜置吸附0.5～1h；細胞接種密度為：每克載體接種0.6～1.5×10⁷個細胞。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，系統參數設定為：溫度T1：37～37.5℃、T2：42～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：30%～70%，振蕩速度30～50rpm。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細胞生長液循環灌注速度隨培養時間的增加逐漸增大，使硅膠管（3）、硅膠管（4）內液體顏色保持基本一致。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，根據細胞耗糖及時補充細胞生長液和10～20g/L葡萄糖，當殘糖量低于1g/L時，進行補液。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0.01～0.3MOI，接毒吸附時間為30～45min。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，設備參數為：溫度T1：36～37℃、T2：39～43℃、T3：35～36℃，pH：7.2～7.6，DO：30%～70%，振蕩速度30～50rpm。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，接毒后18～20h時需要補充循環系統總體積1/10～1/5的2～5倍濃縮DMEM液和10～20g/L的葡萄糖。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟a、步驟b中，細胞生長液或細胞維持液的流動方式為：液體流過灌注袋的方向是從下到上，從灌注袋（6）抽走液體的管道為深層的有孔硅膠管（7）。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟c中，收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液采用三種方法中的任一種：第一種收獲方法為一次性收獲，在病毒高峰期一次性收獲；第二種方法為多次收獲，18～24h時首次收獲，以后每隔6～8h收獲一次，收獲同時補充新細胞維持液，共收獲3～5次；第三種方法為連續流加收獲，24～30h時開始收獲，連續收獲12～16h，控制每分鐘收獲量為細胞維持液總體積0.5～2%，至44～50h時收獲剩余病毒液。