[發明專利]西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點熒光自動化檢測方法

有效

• 申請號: 201110457936.3
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102533994A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王雅春;焦士會;初芹;俞英;張勝利;孫東曉;張毅;張沅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征(AS)致病位點熒光標記引物PCR檢測方法。

背景技術

家畜遺傳缺陷多呈現隱性遺傳模式的原因可能與家畜的生產方式不無關系，尤其是奶牛。人工授精(Artificial?Insemination，AI)及精液低溫凍存技術(Semen?Cryopreservation?Techniques)在奶牛生產繁育中的應用，為奶牛的人工授精育種體系(AI?breeding?system)的建立奠定了堅實基礎。公牛因AI技術可承擔更多母畜配種任務，因而可以被廣泛應用于群體當中，獲得大量后代，使得高產的基因在群體中迅速傳播。精液低溫保存技術使優秀種用公牛不受時間和地域限制，實現全球范圍內遺傳物質的交流(張沅，2001)。經嚴格遺傳評定的驗證公牛(Tested?Bulls)在奶牛遺傳改良中發揮巨大的推動作用。

人工授精技術的廣泛應用使全世界種質資源交換日益頻繁。對種公牛的高強度選擇，使奶牛基因庫縮小，群體平均近交系數大大增加。有研究表明，美國荷斯坦牛的群體近交系數以每年0.1％的速度持續增長，2004年出生的母牛平均群體近交系數高達5.0％(Hansen等，2005)。近交導致群體有效大小減小，一些不利基因的純和，尤其是隱性基因控制的遺傳缺陷，由于攜帶者表現正常，不易通過常規臨床檢測方法檢出，致病基因“潛伏”在群體中很難被剔除。只有當群體中隱性突變基因頻率達到一定程度時，臨床陽性的個體大量出現，帶來不利影響和經濟損失。如荷斯坦牛的Weaver綜合征(單雪松等，2006)、白細胞粘附缺陷病(Bovine?Leukocyte?Adhesion?Deficiency，BLAD)(孫藝等，2006)、脊椎畸形綜合征(Complex?Vertebral?Malformation，CVM)(Chu等，2008)等。因而，尋找隱性缺陷病的致病突變，對致病突變建立準確快速的分子檢測方法，注重對有害基因的識別與淘汰是奶牛育種工作的重要任務之一。

綜上所述，動物遺傳缺陷的致病基因研究是遺傳學的重要組成部分。在家畜育種工作中，建立快速有效的動物遺傳缺陷致病位點的分子檢測方法，對種用動物、進口的遺傳種質、甚至某些發病群體全群進行致病位點檢測，對攜帶致病基因的個體進行標記或淘汰，降低遺傳缺陷在動物群體中的傳播與蔓延帶來的經濟損失。

自1975年，Rieck和Schade首次報道了德系西門塔爾牛群體中出現的一種新的犢牛先天畸形，并定名為牛蜘蛛腿綜合征(AS)。Buitkamp等(2008)年報道了自2004年-2007年，絕跡三十多年的AS病例又在西門塔爾牛中重新出現，并且相繼報道了大量的病例；系譜分析及后期測交試驗證實了該病在德系西門塔爾牛群體中是屬于常染色體單位點控制的隱性遺傳缺陷。Buitkamp等(2009)將德系西門塔爾牛AS致病基因定位于BTA23。Buitkamp等(2011)年對AS的精細定位及群體檢測證實MOCS1基因c.1224_1225delCA突變為西門塔爾牛AS的致病突變。但是，到目前為止，還沒有一種適合商業操作的西門塔爾牛AS致病位點快速準確的檢測方法。本發明需要解決的問題既根據目前的研究進展，設計一種快速準備，成本低廉的檢測方法，以進行商業化試劑盒的生產。

商業化遺傳病檢測試劑盒的生產對我國的畜牧業蓬勃發展意義重大。隨著中國奶牛雜交生產以及肉牛改良工作的開展，大量從國外，包括德國在內，引進西門塔爾優秀種公牛和公牛凍精，其中存在AS攜帶者。為了防患于未然，杜絕AS疾病給我國牛業帶來不必要的損失，早發現、早淘汰是最好的途徑。通過研究建立快速準確的攜帶者分子檢測平臺，完善我國牛遺傳缺陷數據庫，同時結合系譜分析，對引進西門塔爾牛以及現有群體中攜帶者的后代進行篩查，及時淘汰攜帶者，對我國奶業和肉牛業的發展都具有非常重要的意義。

熒光自動化檢測分析方法其基本原理就是，通過在引物上標記熒光發色基團，經PCR擴增后，再采用毛細管電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行產物分離，利用基于熒光掃描技術的遺傳分析儀，結合分子量標準自動計算PCR產物長度大小，是一種常見的用于檢測長度多態的技術手段。此法通過直接判定擴增片段的長度，能夠實現高通量和自動化的分型。另外，該技術具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能與其他位點檢測進行組合檢測實現高通量分型、自動化程度高、無污染性、具實時性、快捷性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

發明內容