[發明專利]一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法及其專用轉錄因子串聯結合序列

有效

• 申請號: 201110457108.X
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102517282A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 秦鈞;丁琛;劉瓊明;劉明偉;劉萬霖;宋雷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;美國貝勒醫學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/10;C07K1/22;C12Q1/68;G01N33/53
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種轉錄因子串聯結合序列，是由3-5bp的接頭序列(Linker)串聯的轉錄因子AP1、AR、BRCA1、CEBPA、CREB1、E2F1、ELK1、ELK4、ESR1、ETS1、EWSR1-FLI1、FEV、FOXA1、FOXC1、FOXD1、FOXF2、FOXI1、FOXL1、FOX03、Fra-1、GATA2、GATA3、GR、HIF1A::ARNT、HLF、HNF1B、HNF4A、HOXA5、INSM1、IRF1、IRF2、JunB、JunD、MAX、MEF2A、MIZF、MYC::MAX、Myf、MZF1?1-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、NR1H2::RXRA、NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBX1、PDX1、PLAG1、PPARG、PR、PXR-1:RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha:RXR-gam、RAR-beta:RXR-alpha、REL、RELA、REST、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5:RFXAP:RFXANK、RORA_1、RORA_2、RREB1、RXR::RAR?DR5、RXRA::VDR、SOX10、SOX9、SP1、SPI1、SPIB、SRF、SRY、STAT1、STAT5A、T3R-beta1、TAL1::TCF3、TBP、TEAD1、TFAP2A、TLX1::NFIC、TP53、USF1、WT1-del2、WT1-KTS、WT1I、WT1I-del2、WT1I-KTS、XBP-1、YY1和ZNF354C等DNA結合元件中的一個或多個后得到的DNA序列。

2.根據權利要求1所述的轉錄因子串聯結合序列，其特征在于：所述轉錄因子串聯結合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.權利要求1或2所述的轉錄因子串聯結合序列在富集分離內源轉錄因子及其復合物中作為生物素標記的DNA誘餌的應用。

4.一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法，包括以下步驟：

1)將權利要求1或2所述的轉錄因子串聯結合序列連接入目標載體的多克隆位點中，得到攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體；

2)設計并合成一對生物素標記的引物，其正、反向引物可分別與目標載體多克隆位點上游及下游200bp處退火，以步驟1)中攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體為模板，在所述引物對的引導下進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的擴增片段，得到高純度生物素標記的DNA誘餌；

3)將步驟2)獲得的高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上；

4)內源轉錄因子的分離純化：提取細胞核蛋白，將步驟3)獲得的固定有DNA誘餌的磁珠與細胞核蛋白進行孵育，洗滌，細胞核蛋白中內源轉錄因子及其復合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中的目標載體為pUC57、pET24a+、pGEX4T-2、pGEX4T-1、pCMV-Myc、pGH或pcDNA-Myc。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟2)中100μl?PCR反應體系為：10×ExTaq?Buffer?10μl，dNTPs(2.5mM/dNTP)10μl，pUC57-sdTF?1μl(50ng)，上、下游引物各1μl(1nmol)，ExTaq?0.5μl，H₂O?87.5μl；PCR反應條件為：先94℃2min，然后94℃45s，60℃45s，72℃2min，共35個循環，再72℃7min，最后4℃30min。

8.根據權利要求4至7任一所述的方法，其特征在于：所述步驟4)中細胞核蛋白的提取采用Dounce勻漿的方法，先用低鹽溶液破細胞膜，離心分離得到的細胞核經dounce勻漿及高鹽溶液溶解，高速離心分離出核蛋白，經BC150透析恢復內源蛋白及其復合物的天然屬性。