[發(fā)明專利]信號(hào)放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110456124.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN102565383A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳堅(jiān);陳春香
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吳堅(jiān)
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫快速分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種信號(hào)放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫檢測(cè)技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品安全等領(lǐng)域最基本也是最常用的檢測(cè)技術(shù)之一。它廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)臨床、環(huán)境檢測(cè)，以及食品和微生物污染的檢測(cè)中。免疫檢測(cè)技術(shù)是基于抗體抗原反應(yīng)的原理對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量定性分析的檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的重要研究手段，在生物分析檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

熒光免疫測(cè)定是指將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)(熒光標(biāo)記物對(duì)抗體或者抗原進(jìn)行標(biāo)記)結(jié)合起來(lái)，并通過(guò)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的方法。最終目的是通過(guò)將抗體與抗原的特異性反應(yīng)和熒光信號(hào)相結(jié)合，達(dá)到定量檢測(cè)的目的。

斑點(diǎn)熒光免疫滲透試驗(yàn)，在斑點(diǎn)金免疫滲透試驗(yàn)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，后發(fā)展為斑點(diǎn)熒光免疫滲透試驗(yàn)，而斑點(diǎn)熒光免疫滲透試驗(yàn)則是用熒光性物質(zhì)代替了膠體金作為標(biāo)記物，采用免疫滲透技術(shù)、熒光標(biāo)記物和固相載體相結(jié)合的一種檢測(cè)方法。

熒光免疫層析是在膠體金免疫層析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，如同層析一般。

目前，F(xiàn)ITC、羅丹明、量子點(diǎn)、熒光微球等熒光標(biāo)記物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于熒光免疫分析技術(shù)中。熒光免疫檢測(cè)方法具有高特異性、敏感性高、速度快的特點(diǎn)。但是該檢測(cè)方法在應(yīng)對(duì)非常微量的物質(zhì)時(shí)，也存在信號(hào)低，噪聲干擾大，傳統(tǒng)方法難以檢出等問(wèn)題。因此，發(fā)展新的免疫檢測(cè)方法，提高檢測(cè)的靈敏度是目前分析檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的迫切要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了信號(hào)放大型免疫熒光探針的制備方法，將熒光標(biāo)記物標(biāo)記在連接有多羧基大分子和聚賴氨酸或者連接有生物素-鏈霉親和素和聚賴氨酸的抗體復(fù)合物上，使免疫反應(yīng)的熒光信號(hào)大大放大，提高了熒光免疫檢測(cè)的靈敏度。

一種信號(hào)放大型免疫熒光探針的制備方法，包括：

(1)在縮合劑的存在下，將對(duì)苯二胺和均苯三甲酸加入有機(jī)溶劑中，于80-100℃縮合反應(yīng)3-5h，得到多羧基大分子；

(2)將步驟(1)得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的溶液中進(jìn)行活化，然后加入抗體，反應(yīng)0.5-2h；再加入聚賴氨酸，繼續(xù)反應(yīng)0.5-2h，得到表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子；

(3)用熒光標(biāo)記物對(duì)步驟(2)制得的表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子進(jìn)行標(biāo)記，制得信號(hào)放大型免疫熒光探針。

步驟(1)中，所述的縮合劑可以為三苯基亞磷酸鹽(TPP)與吡啶(Py)的混合物；所述的有機(jī)溶劑可以為N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。

所述對(duì)苯二胺與均苯三甲酸的摩爾比優(yōu)選為1∶0.8-1∶1.2；更優(yōu)選為1∶1。對(duì)苯二胺和均苯三甲酸作為反應(yīng)單體，在縮合劑的存在下能縮合得到多羧基大分子。

優(yōu)選地，每80-100ml?N-甲基-2-吡咯烷酮中，所述對(duì)苯二胺的加入量為10mmol，均苯三甲酸的加入量為10mmol，三苯基亞磷酸鹽的加入量為20-30mmol，吡啶的加入量為5-15ml。

所述的縮合反應(yīng)過(guò)程中對(duì)溶液進(jìn)行攪拌，確保混合物互溶成均相。

所述的縮合反應(yīng)完成后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行后處理得到多羧基大分子；所述的后處理可以為：將縮合反應(yīng)3-5h后的反應(yīng)產(chǎn)物加入含有鹽酸的甲醇溶液中終止反應(yīng)，分離得到縮合物沉淀，再對(duì)縮合物沉淀依次進(jìn)行重結(jié)晶、洗滌和干燥處理。

其中，所述含有鹽酸的甲醇溶液中鹽酸的濃度為10-15mol/L；所述重結(jié)晶所用的試劑為N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇混合液；所述洗滌所用的試劑為熱的甲醇；所述的干燥處理為：將縮合物沉淀置于80-120℃烘箱中干燥10-15h。

步驟(2)中，所述含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的溶液的溶劑可以為磷酸鹽緩沖液(PBS)和二甲基亞砜(DMSO)的混合液。

所述的抗體可以為單抗或多抗。

所述步驟(1)得到的多羧基大分子、抗體和聚賴氨酸的摩爾比優(yōu)選為1∶2∶20-1∶3∶50。

所述的活化時(shí)間優(yōu)選為10-15min。

步驟(3)中，所述的熒光標(biāo)記物可以為FITC、羅丹明、量子點(diǎn)或熒光微球。

本發(fā)明還提供了另一種信號(hào)放大型免疫熒光探針的制備方法，包括：