[發明專利]一種提取高純度微囊藻毒素的方法

無效

• 申請號: 201110455131.5
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102516367A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 母銳敏;袁學良;石敬華;韓雪梅
• 申請（專利權）人: 山東建筑大學
• 主分類號: C07K7/56
• 分類號: C07K7/56;C07K1/14
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王立曉

技術領域

本發明涉及一種微囊藻毒素的提取方法，具體為一種從產毒銅綠微囊藻中提取高純度微囊藻毒素的方法，屬于環保技術領域。

背景技術

近年來，隨著全球水體富營養化程度的加劇，世界各地有害藻類水華(Harmful?Algal?Blooms，HABs)事件發生的頻率和幅度日趨增加。藻類水華已成為嚴重影響水環境質量和水體生態安全的全球性問題，不僅極大的危害人類健康和其他生物安全，也給全球造成巨大的經濟損失。有些水華藻類在代謝過程中或藻體破裂后向水體中排出藻毒素，給人類健康、水生動物、家禽等帶來極大危害。如銅綠微囊藻所產生的微囊藻毒素(Microsystins，簡稱MC)是一類具有生物活性的環狀七肽化合物，近幾十年來，國內外動物試驗、人群流行病學調查表明微囊藻毒素具有機體肝毒性、促癌、胚胎毒性、遺傳毒性、免疫損害等作用。

微囊藻毒素是一類具有生物活性的七肽單環肝毒素，相對分子量在900-1100之間。到目前為止，發現的微囊藻毒素的異構體達60多種，其中存在較多且毒性較大的是微囊藻毒素MC-LR，MC-YR，MC-RR。能產生微囊藻毒素的藻類主要有微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、顫藻(Oscillatoria)和念珠藻(Nostoc)等。由于MC-LR存在較為普遍，毒性較強，且已分離培養出標準純品，故現在藻毒素研究常以其為代表性指標，WHO以MC-LR含量為基準推薦飲水藻毒素標準為1.0μg/L。

隨著對微囊藻毒素降解研究的廣泛開展，科研人員對微囊藻毒素樣品的需求量也越來越大，對水體中微囊藻毒素的檢測及降解研究已成為水環境領域的一項重要研究內容。

目前只有少數幾家國外公司才能購買到高純度(純度95％以上)的MC-LR等標準品，價格昂貴(如美國sigma公司500mg標準品價格約3000元)，購買手續繁雜，等候時間過長等因素給研究帶來極大的不便。如果實驗所需微囊藻毒素樣品全部靠進口標準品來完成，也將大大增加實驗成本。因此，開發具有自主知識產權的高純度微囊藻毒素提取方法對于在水環境及衛生領域展開更多關于微囊藻毒素的研究具有重要意義。

中國專利200910033693公開了一種分離、純化微囊藻毒素的方法，產微囊藻毒素的藍藻用1∶20～80的溶劑提取，提取液通過SPE柱凈化，然后利用恒流泵、C18層析柱、自動部分收集器構成的柱層析系統對微囊藻毒素進行分離純化，流動相由35～50％水、50～65％甲醇以及0.05～0.1％酸組成。由于甲醇濃度偏低，還有酸的存在會使藻毒素部分降解，塑料或是玻璃容器會對MC有吸附；超聲破碎藻細胞使其中的藻毒素和其他物質同時釋放，不利于高純度藻毒素的獲得。

發明內容

本發明的目的是提供一種提取高純度微囊藻毒素的方法，該方法高效、經濟、純度高，解決了目前微囊藻毒素標準品價格昂貴、獲得手續繁雜等問題。

本發明采取的技術方案為：

一種提取高純度微囊藻毒素的方法，包括步驟如下：

(1)水樣預處理：將銅綠微囊藻水樣經液氮反復凍融2-4次，以破碎藻細胞，釋放胞內微囊藻毒素MC-LR，然后將凍融后的水樣離心取上清液備用；

(2)SPE固相萃取柱的預處理、MC-LR的富集與純化：用甲醇清洗固相萃取柱2-4次，再用超純水清洗2-4次；向清洗后的固相萃取柱內通入步驟(1)的上清液過柱，過柱完后用甲醇水溶液作淋洗液清洗富集了MC-LR的固相萃取柱，除去雜質；

(3)MC-LR的溶出與濃縮：用100％甲醇作為洗脫液清洗富集了MC-LR的固相萃取柱以洗脫MC-LR，使MC-LR溶出，將溶出的MC-LR-甲醇混合溶液置于旋轉蒸發儀，40-60℃，旋轉蒸發10-20min。

上述步驟(1)中所述的銅綠微囊藻水樣藻細胞濃度約10⁷個/ml，所述的離心在8000-10000rpm速度下離心8-12分鐘。

步驟(2)中所述的固相萃取柱為C18固相萃取柱；所述的過柱速度均為5ml/min；所述的甲醇水溶液濃度為10％-20％(v/v)，洗滌1-2次。

本發明的有益效果是：

(1)本專利用的是100％的色譜純甲醇作流動相，提取效果更好，樣品保留更穩定，而且經過旋轉蒸發儀濃縮后，藻毒素樣品的純度更高，可提取得到毫克級MC-LR，雜質少，純度高；