[發明專利]一種嗜鉻粒蛋白A化學發光免疫分析試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201110455048.8
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102520195A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 王立凱;潘學繼;單存海
• 申請（專利權）人: 天津市協和醫藥科技集團有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N21/76
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及免疫分析醫學技術領域，具體地涉及一種人血清中嗜鉻粒蛋白A(CgA)化學發光免疫分析試劑盒及其制備方法。

背景技術

嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin?A，CgA)是一種由439個氨基酸組成的酸性可溶性蛋白，為嗜鉻蛋白家族的主要成員。廣泛存在于神經內泌細胞中，血漿中CgA濃度的升高可提示神經內分泌來源的腫瘤。幾乎所有類型的神經內泌腫瘤的診斷中都會出現CgA水平的升高。因此神經內泌腫瘤的診斷中，CgA是極具價值的診斷標志物。若以32.7U/L作為臨界值，CgA對胰腺腫瘤的靈敏度和特異性分別為82.1％和96.2％，對嗜鉻細胞瘤的靈敏度和特異性分別為88.5％和96.2％。因此，CgA的定量檢測對于胰腺癌及嗜鉻細胞癌的臨床診斷具有十分重要的意義。

目前對CgA的測定報道的方法主要有酶聯免疫分析法(ELISA)、免疫放射分析法(IRMA)等。如上海研輝生物科技有限公司提供的進口試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人嗜鉻蛋白A(CgA)水平。用純化的人嗜鉻蛋白A(CgA)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入嗜鉻蛋白A(CgA)，再與HRP標記的羊抗人抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。用酶標儀測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人嗜鉻蛋白A(CgA)含量。再如中國協和醫科大學采用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)對血清CgA水平進行檢測。結果表明，血清CgA濃度與CgA在嗜鉻細胞瘤組織中的表達強度相關，與腫瘤重量呈正相關，高水平的血清CgA濃度提示腫瘤很可能為惡性。ELISA方法受影響因素較多，很容易造成結果失真，準確性較差。因此該技術在科研中應有較多，而在臨床檢測中應有并不多。

法國CIS公司研制了一種免疫放射分析法檢測CgA的試劑盒，用一株CgA單克隆抗體包被試管，另一株CgA單抗用碘-125(¹²⁵I)標記，通過雙抗體夾心法檢測血清中CgA的濃度。該方法操作簡單，測定結果比較準確可靠。但由于碘-125具有放射性污染，在我們對環保要求越來越高的今天，放射免疫分析技術顯然不符生物醫藥技術的發展趨勢。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種靈敏度高、準確度高、又沒有放射性污染的嗜鉻粒蛋白A化學發光免疫分析試劑盒。

本發明的第二個目的是提供一種嗜鉻粒蛋白A化學發光免疫分析試劑盒的制備方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種嗜鉻粒蛋白A化學發光免疫分析試劑盒，包括如下組分：

1)嗜鉻粒蛋白A標準品；

2)辣根過氧化物酶標記的嗜鉻粒蛋白A單克隆抗體；

3)嗜鉻粒蛋白A單克隆抗體包被的磁顆粒；

4)白色不透明微孔板；

5)洗滌液；

6)化學發光底物A及B工作液。

所述辣根過氧化物酶標記的嗜鉻粒蛋白A單克隆抗體是用下述方法制成：

①稱取CgA單克隆抗體2.0mg，加入1～2ml濃度為0.05mol/L，pH＝7.5的碳酸鹽緩沖液溶解，4℃儲存備用；

②稱取10.0mg的辣根過氧化物酶，加入1.0ml去離子水，振蕩，溶解后，取出0.14～0.28ml，加入0.1mol/L的NaIO₄溶液0.2ml，室溫下避光反應1～2小時；

③將步驟①獲得的液體與步驟②的獲得的液體混合，室溫下避光反應4～8小時；

④加入200μl濃度為5mg/ml的NaBH₄水溶液，室溫下避光反應1～2小時；

⑤用0.02M?PBS透析12-24小時，用HPLC二次純化，收集蛋白峰并于-20℃下冷凍保存。

所述嗜鉻粒蛋白A單克隆抗體包被的磁顆粒是用下述方法制成：

①取5mL磁顆粒質量含量為2.5％的PBS溶液，用磁板分離棄上清，用去離子水洗磁顆粒；

②用0.02mol/L?pH＝6.2的PBS洗磁顆粒；

③用0.02mol/L?pH＝6.2的PBS調整總體積為5～10ml；

④加CgA單抗5mg放在搖床上進行勻化10～20分鐘；

⑤加入碳二亞胺5～10mg；室溫，放在搖床上進行勻化5～10小時；

⑥用0.1mol/L?pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌2次；