[發(fā)明專利]一種定量檢測肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析方法及其試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110453813.2
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102520173A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王東
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳康美生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573
• 代理公司: 深圳市深佳知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44285
• 代理人: 唐華明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，特別涉及一種定量檢測急性心肌梗塞標(biāo)志物肌酸激酶同工酶的熒光免疫層析方法及其試劑盒。

背景技術(shù)

當(dāng)前，心血管疾病在世界范圍內(nèi)已成為成年人最大的潛在殺手，僅在美國就有超過7000萬人患有心臟病，每年大約有600萬人因胸痛而進(jìn)急診室，每年急性心肌梗死(AMI)的死亡人數(shù)超過了50萬，在我國，心血管疾病的患病率、發(fā)病率及其危險(xiǎn)因素水平均呈不斷上升趨勢。近年來統(tǒng)計(jì)，心血管病的死亡率在人口死亡中占40％，已高于歐美國家，屬心血管病高發(fā)國。因此，只有做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死后果，最大限度的改善心血管患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

對心血管疾病，常用的檢測指標(biāo)為心肌酶譜系列。心肌酶是指心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)，具有催化心肌細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電活動(dòng)的作用。心肌酶譜包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶MB(CK-MB)等。如果心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、破裂，這些酶類就會(huì)釋放人血液當(dāng)中，使之升高。因此，心肌酶譜的升高程度可以間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。其中CK和CK-MB是靈敏度較高的指標(biāo)，能在發(fā)病早期心肌尚未大面積壞死時(shí)，在患者血液中檢測出來，第一時(shí)間為臨床提供可靠資料。

CK是由兩種不同亞基(M和B)組成的二聚體，這樣正常人體組織主要含3種同工酶，即CK-MM、CK-BB、CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉細(xì)胞中，CK-BB主要存在于腦細(xì)胞中，CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞中。

CK-MB是目前常用的心肌損傷標(biāo)志物，曾一度被視為診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CK-MB在急性心肌梗死發(fā)病后4～8h內(nèi)增高，24h達(dá)峰值，兩三天恢復(fù)正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。

傳統(tǒng)上多用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法等測定血清中的CK-MB。但酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測耗時(shí)長；化學(xué)發(fā)光法對技術(shù)要求高，不易在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)開展。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢，然而當(dāng)遇到某些樣本中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。

中國專利申請?zhí)朇N200610114997.9公布了一種血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。該申請?zhí)枌＠饕眉∷峒っ复呋姿峒∷崤c二磷酸腺苷反應(yīng)生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使魯米諾氧化而發(fā)光。中國專利申請?zhí)?00520041211.6披露了一種心血管疾病診斷和預(yù)測多指標(biāo)蛋白芯片檢測試劑盒，該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法(如辣根過氧化氫酶和魯米諾)檢測，并能同時(shí)檢測C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶等八種抗體。雖然化學(xué)發(fā)光法靈敏度較高，但重復(fù)性和穩(wěn)定性均較差，且儀器復(fù)雜、昂貴，不能單人份檢測，限制了他們的廣泛應(yīng)用。

美國專利US60/576327和60/592202，及其在中國申請的專利200580025931.6都對膠體金免疫層析檢測進(jìn)行了論述。但相比于熒光檢測，吸光度檢測具有靈敏度低、線性范圍窄等缺陷。

量子點(diǎn)(quantum?dots，QDs)又稱半導(dǎo)體納米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素組成的穩(wěn)定的、尺寸介于1～20nm之間的納米微晶體。其具有許多優(yōu)良的光學(xué)特性：(1)量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜窄而對稱，熒光發(fā)射波長可調(diào)，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區(qū)。(2)量子點(diǎn)的吸收光譜寬且連續(xù)，可實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)，多元發(fā)射，適合于多色標(biāo)記。(3)量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光學(xué)穩(wěn)定性。CdSe/ZnS量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性是羅丹明6G的100倍以上。(4)量子點(diǎn)摩爾吸光系數(shù)可以高達(dá)106L/(mol·cm)，且熒光量子產(chǎn)率高(50～80％)，因而可產(chǎn)生較強(qiáng)熒光信號。(5)量子點(diǎn)斯托克斯位移較大，熒光壽命長(20～50ns)，使得信號可以顯著區(qū)分于背景和其它熒光基團(tuán)。量子點(diǎn)是一種理想的應(yīng)用于超靈敏和多組分生物化學(xué)分析的熒光探針。將量子點(diǎn)與抗體結(jié)合可應(yīng)用于熒光免疫分析和檢測。

針對現(xiàn)有CK-MB檢測方法靈敏度低、檢測范圍窄和定量不準(zhǔn)確等不足，量子點(diǎn)熒光定量檢測方法利用量子點(diǎn)多波長激發(fā)、高強(qiáng)度熒光強(qiáng)度、發(fā)射峰窄、峰形對稱、發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，可提供一種量子點(diǎn)標(biāo)記快速免疫層析試紙條的檢測方法，對CK-MB進(jìn)行定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容