[發(fā)明專利]一種三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇/核酸腦靶向膠束及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110453577.4
• 申請(qǐng)日: 2011-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN103182087A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜同英;王思玲;高亦鯤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K47/42
• 分類號(hào): A61K47/42;A61K48/00;A61K9/10;A61P25/28
• 代理公司: 沈陽杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥基因治療領(lǐng)域，涉及新型高效非病毒載體的制備方法和技術(shù)，具體涉及一種由乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束及其制備方法。?

背景技術(shù)

世界上罹患神經(jīng)退行性等腦部疾病的人數(shù)正逐年增加，但治療此類疾病的有效藥物還為數(shù)不多。核酸類藥物因具有特異性高，作用迅速、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)已成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究的前沿。?

但核酸類藥物在應(yīng)用中存在著難以克服的問題：一是體內(nèi)存在大量核酸酶，它可以水解核酸的磷酸二酯鍵，使得藥物在到達(dá)靶點(diǎn)前就被降解而失效；二是核酸類藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性較差，難于通過細(xì)胞膜到達(dá)靶部位。目前解決上述問題的方法主要采用病毒或非病毒載體實(shí)現(xiàn)核酸類藥物的給藥。其中，以病毒外殼作載體則可能引起宿主的血清免疫反應(yīng)。相比之下，非病毒載體具有免疫源性低、成本低、不限制基因藥物體積等諸多優(yōu)勢，已成為目前核酸類藥物載體的重要研究方向。目前研究的非病毒載體主要包括：脂質(zhì)體、納米粒及多聚陽離子等。此類載體載核酸多采用帶有高密度正電荷的陽離子脂質(zhì)或陽離子聚合材料與帶負(fù)電的核酸借助靜電作用形成脂質(zhì)體、納米粒、膠束等可控性強(qiáng)、毒性低的傳遞系統(tǒng)。?

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體循環(huán)之間血腦屏障（BBB）的存在，限制了許多有潛力的藥物（尤其是核酸藥物）從血液進(jìn)入腦部發(fā)揮作用。目前促進(jìn)藥物透過BBB的方法主要有以下四種。其中，人為開啟BBB上的致密連接，會(huì)無選擇性的使有害物質(zhì)與藥物同時(shí)入腦；對(duì)藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造可能導(dǎo)致藥物療效及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)降低或改變；改變給藥途徑主要包括頸動(dòng)脈輸注以及鼻腔給藥，前者易對(duì)腦造成傷害，后者生物利用度低，很難滿足臨床要求；通過受體介導(dǎo)則不存在上述缺點(diǎn)，是目前腦部藥物傳遞系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)。?

2007年，Priti?Kumar等（Kumar?P,?Wu?HQ,?McBride?JL,?et?al.?Transvascular?delivery?of?small?interfering?RNA?to?the?central?nervous?system.?Nature,?2007,?448:?39-43）研究報(bào)道一種含有29個(gè)氨基酸的小肽RVG具有乙酰膽堿受體的靶向性，乙酰膽堿受體主要分布在腦細(xì)胞上，包括被用作BBB模型的腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞，這可使該肽修飾的載體同時(shí)具有高效透過BBB與靶向腦細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)證明，該小肽不僅自己可通過BBB，而且通過在羧基端連接的9聚精氨酸可將FITC標(biāo)記的siRNA載帶入腦。靜脈注射給藥后，siRNA有效實(shí)現(xiàn)靶基因沉默作用，而且在脾和肝中檢測不到FITC熒光，這表明該小肽具有強(qiáng)趨腦性和腦細(xì)胞靶向性。?

含PEG側(cè)鏈和聚陽離子主鏈的接枝共聚物與帶有負(fù)電荷的核酸可以通過靜電復(fù)合自組裝成聚離子復(fù)合膠束該膠束作為核酸類藥物腦靶向傳遞系統(tǒng)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：核/殼結(jié)構(gòu)既能延長藥物在血液中的滯留時(shí)間，又能保護(hù)藥物避免與酶接觸；膠束粒徑小，穿透力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，連接腦靶向功能肽后可實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向；可通過血腦屏障；制備過程溫和，可最大限度地保持藥物活性。?

綜上，本發(fā)明制備了具有腦靶向功能肽RVG修飾的核酸聚離子復(fù)合膠束，以實(shí)現(xiàn)核酸類藥物通過血腦屏障和腦主動(dòng)靶向定位，并解決其在體內(nèi)易降解、不穩(wěn)定及轉(zhuǎn)染效率低等臨床應(yīng)用缺陷。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是制備一種由乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸的腦靶向膠束，以實(shí)現(xiàn)核酸類藥物通過血腦屏障和腦主動(dòng)靶向定位，并解決其在體內(nèi)易降解、不穩(wěn)定及轉(zhuǎn)染效率低等臨床應(yīng)用缺陷。?

???????本發(fā)明以針對(duì)阿爾茨海默癥設(shè)計(jì)的siRNA（序列為5′-GUGCCUACCUGGACAAGAAdTdT-3′）作為核酸類藥物的模型藥，采用的技術(shù)方案如下（如圖1）。?

將殼聚糖（Chitosan）季銨化制得三甲基殼聚糖（TMC），在三甲基殼聚糖上接入聚乙二醇制得三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇，然后，在聚乙二醇的另一端接入腦靶向功能肽RVG，制得乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽（TMC-g-PEG-RVG），使其具有透過血腦屏障與腦靶向的功能，最后，將該材料與荷負(fù)電的核酸通過靜電復(fù)合作用自組成腦主動(dòng)靶向膠束。?

本發(fā)明所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽的制備包括如下步驟：?

1)????????殼聚糖的純化：

本發(fā)明所述殼聚糖重均分子量為5–500kD，脫乙酰度為80%–95%。

具體純化步驟如下所述：?