[發明專利]生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201110453388.7
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN103820344A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 張學禮;黃璐琦;戴住波;劉怡
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所;中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/63;C12P15/00;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用。?

背景技術

次丹參酮二烯(Miltiradiene)是重要藥用植物丹參中提取的脂溶性二萜成分，為丹參酮類化合物共同的前體物質(Wei?Gao?et?al.，2009，Organic?Letters，11：5170-5173)。這類化合物(如隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB、二氫丹參酮)在抗炎，心腦血管，抗腫瘤等方面有非常好的應用前景，目前與其相關的產品中，已有復方丹參片、復方丹參滴丸等銷售額上數億人民幣的王牌產品上市。注射用丹參酮IIA磺酸鈉已廣泛用于治療冠心病、心肌梗死等疾病，就目前丹參酮IIA的原料市場情況來看，含量20％的4500元/kg；含量50％的8000元/kg；含量為98％的高達3.6萬元/kg。可見整個與丹參酮類化合物相關的產業有巨大的市場需求，經濟效益也非常可觀。目前丹參酮類化合物的主要來源是通過中藥材丹參中直接提取，但隨著開墾荒地、荒山伐林丹參野生資源的生長環境遭到嚴重破壞，丹參資源日趨減少；人工種植過程中也遇到品種退化，大量的土地和人力成本等因素。丹參酮類化合物產量已經遠不能滿足社會的需求，嚴重影響了丹參的臨床應用和丹參酮類制藥原料中間體的開發和應用，亟待需要提供新的資源途徑。?

目前利用合成生物學的原理，設計和改造微生物菌株來生產天然產物已被國際認為是一種最有潛力的方法，如在大腸桿菌中生產紫杉醇的前體紫杉二烯已達到1000mg/L(Parayil?Kumaran?Ajikumar?et?al.，2010，Science，330：70-74)；銀杏內酯類(Ginkgolides)前體左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大腸桿菌工程菌中達到700mg/L的產量(EffendiLeonard?et?al.，2010，PNAS，107(31)：13654-13659)；在酵母工程菌中生產青蒿素(Artemisinin)的前體青蒿酸(Artemisinic?acid)最高達到100mg/L(Dae-Kyun?Ro?et?al.，2006，Nature，440：940-943)；目前國內在青蒿素和紫杉醇等藥物分子的生物合成方面有相關研究。?

次丹參酮二烯為植物丹參體內萜類合成途徑的產物，由丹參細胞中線粒體、細胞溶質和內質網存在的甲羥戊酸(MVA?Pathway)代謝途徑與在質體中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛(MEP?Pathway)代謝途徑共同合成。其中前體物質牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)為異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)經過牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(GGPS)催化得到，GGPP可以被丹參柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)和次丹參酮二烯合酶(SmKSL)共同催化為次丹參酮二烯，圖1。微生物大腸桿菌中存在丙酮酸/磷酸甘油醛途徑，在前面的研究中，?高偉等人研究策略采用了文獻報道的大腸桿菌表達系統，以商用雙表達載體pACYCDuet共同表達基因SmCPS和SmKSL，但效果不理想，只能獲得了毫克級的次丹參酮二烯(Wei?Gao?et?al.，2009，Organic?Letters，11：5170-5173)。然而，作為傳統發酵工藝中常用菌株：釀酒酵母，在其體內存在生產萜類成分的甲羥戊酸途徑，其中產萜類成分麥角甾醇(Ergosterol)能達到生物量的4.6％(Arnezeder，C.et?al.，1990，Biotechnol?lett.，12：277-282)；二萜香葉酰香葉酰醇(GGOH)也能達到283mg/L(Tokuhiro，K.et?al.，2009，Appl?Environ?Microbiol.，75：5536-5543)，由此利用酵母的優化的甲羥戊酸途徑生產次丹參酮二烯具有很大潛力。?

發明內容

本發明的一個目的是提供高產次丹參酮二烯釀酒酵母工程菌株ZD-Tans-001。?

本發明所提供的釀酒酵母工程菌株ZD-Tans-001，其保藏號為CGMCC?No.5296。?

本發明的另一個目的是提供一種基因工程菌的構建方法。?

本發明所提供的基因工程菌的構建方法，包括以下步驟：?

在出發釀酒酵母中引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母I。?

所述方法還包括以下步驟：?

在所述重組釀酒酵母I中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母II。?