[發(fā)明專利]生產(chǎn)次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110453388.7 | 申請日： | 2011-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN103820344A | 公開（公告）日： | 2014-05-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張學(xué)禮;黃璐琦;戴住波;劉怡 | 申請（專利權(quán)）人： | 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所;中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 |
| 主分類號： | C12N1/19 | 分類號： | C12N1/19;C12N15/63;C12P15/00;C12R1/865 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 300308 天津*** | 國省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 生產(chǎn) 丹參 酮二烯 釀酒 酵母 基因工程 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae?BY4742)ZD-Tans-001，其保藏號為CGMCC?No.5296。
2.一種基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
在出發(fā)釀酒酵母中引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法還包括以下步驟：
在所述重組釀酒酵母I中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母II。
在所述重組釀酒酵母I中提高牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母III。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法還包括以下步驟：
在所述重組釀酒酵母III中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母IV。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶是通過轉(zhuǎn)化入攜帶外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因。
所述提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2的活性是通過轉(zhuǎn)化入攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2基因。
所述提高牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性是通過轉(zhuǎn)化入攜帶牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：
所述在釀酒酵母染色體上整合基因是整合在δDNA位點(diǎn)。
所述攜帶柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質(zhì)粒，復(fù)制位點(diǎn)為2MICRON，篩選標(biāo)記為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記URA3，柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的啟動子均為釀酒酵母的半乳糖激酶1啟動子GAL1。
所述攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調(diào)控因子蛋白UPC2基因的質(zhì)粒，復(fù)制位點(diǎn)為2MICRON和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標(biāo)記為亮氨酸營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記LEU2和基因素(G418)抗性篩選標(biāo)記KanMX中的一種，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶1啟動子ADH1，萜類調(diào)控因子蛋白UPC基因的啟動子為釀酒酵母的翻譯延伸因子1啟動子TEF1。
所述攜帶牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質(zhì)粒，復(fù)制位點(diǎn)為2MICRON和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標(biāo)記為組氨酸營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記HIS3和潮霉素篩選標(biāo)記hphNT1中的一種。一種牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶基因和法呢基焦磷酸合酶基因融合在一起，啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶1啟動子ADH1，另一種牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶基因的啟動子為釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶啟動子PGK1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述柯巴基焦磷酸合酶為丹參的柯巴基焦磷酸合酶。
所述次丹參酮二烯合酶為丹參的次丹參酮二烯合酶。
所述萜類調(diào)控因子蛋白UPC2為釀酒酵母固醇調(diào)控因子蛋白UPC2的突變。
所述3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶為釀酒酵母的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1截取5’部分序列的功能蛋白。
所述牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶一種為釀酒酵母的牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶；另一種為密碼子優(yōu)化的嗜酸熱硫化葉菌的牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶，其編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?所示DNA。所述法呢基焦磷酸合酶為釀酒酵母的法呢基焦磷酸合酶。
所述出發(fā)釀酒酵母為釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742。
8.由權(quán)利要求2-7中任一所述的方法構(gòu)建得到的重組釀酒酵母。
9.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母或權(quán)利要求8所述重組釀酒酵母在生產(chǎn)次丹參酮二烯中的應(yīng)用。
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