[發明專利]飼料樣品中腸毒性大腸桿菌的快速測定引物及其應用

有效

• 申請號: 201110452838.0
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102559892A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉瀅;謝飛;胡婷;劉婷;彭子欣
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;漳州大北農農牧科技有限公司;哈爾濱大北農牧業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于飼料科學與飼料添加劑檢測技術領域，具體涉及一種飼料樣品中腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic?Escherichia?coli)K88的快速測定引物及其應用。?

背景技術

大腸菌群及其所產生的腸毒素能引起動物和人的食物中毒，最常見的癥狀是動物和人的腹瀉。飼料中大腸菌群的存在，不僅直接危害到畜禽健康，嚴重時會引起畜禽中毒死亡，造成嚴重經濟損失；致病性大腸桿菌主要有腸毒性大腸桿菌(產腸毒素性大腸桿菌)(Enterotoxigenic?Escherichia?coli，ETEC)，腸致病性大腸桿菌(EPEC)，腸出血性大腸桿菌(ELEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)。其中ETEC是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最主要的致病菌之一。ETEC本身具備兩個致病因素：一是宿主特異性菌毛(黏附素，黏附因子，定植因子)，通過菌體粘著于小腸的上皮細胞上，以抵抗腸道蠕動和腸內容物的沖刷作用，從而使細菌在定居部位大量繁殖；二是腸毒素，即耐熱腸毒素(ST)和不耐熱腸毒素(LT)，ST具有抗原性，LT僅有弱抗原性。腸毒性大腸桿菌致病性與其具有粘附性菌毛和產腸毒素密切相關。致仔豬腹瀉腸毒素性大腸桿菌粘附性菌毛主要有K88，K99，F41和987P，目前檢測腸毒性大腸桿菌菌毛的方法有電子顯微鏡法、D甘露糖抵抗雪凝試驗、細胞粘附試驗、基因探針技術和免疫血清學反應等，商品化的快速檢測方法主要包括特異性檢驗的培養基、檢測試紙片等，一般是利用大腸桿菌特異性酶檢測鑒定大腸桿菌，如可利用Gud酶底物有效檢測大腸桿菌。法國科瑪嘉CHROM?agar?Ecoli是目前應用最廣泛的大腸桿菌顯色培養基，廣東環凱公司也開發出了商業化的大腸桿菌顯色培養基，這種利用顯色培養基檢測大腸桿菌的方法雖然成本較低，但得到檢測結果需24h-48h，時間較長，且單一方法檢測準確性不高，需多種方法復合使用，以提高檢測的準確性，縮短檢測時間。?

為了有效地控制飼料的產品質量，進一步加強飼料產品及飼料原料的質量監督管理，有必要制定飼料產品中大腸菌群的檢測方法及相關飼料產品中大腸菌群允許量。目前，國際標準化組織采用兩種大腸菌群檢測方法標準來檢測食品和飼料中的大腸菌群，一是最大或然數法(Most?probable?number，MPN)方法(ISO?7251；1993(E))，另一為選擇性培養基菌落?計數法。其中應用最廣泛的是MPN技術，如英國、美國等均采用此法，但此方法具有檢測時間長，易出現假陽性，敏感度低等問題，國內尚未制定飼料中大腸菌群檢測方法。?

近年來發展起來的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real?time?polymerasechainreaction，RT-PCR)技術以其特異性強、靈敏度高、速度快等優點在基因表達水平分析、病原體基因的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前細菌快速檢測的主要方法。但是，目前，國內還未見報道根據腸毒性大腸桿菌K88菌毛特異基因的SYBR?Green?I熒光定量PCR方法。?

發明內容

【要解決的技術問題】?

本發明的目的在于提供一種飼料樣品中腸毒性大腸桿菌(產腸毒素性大腸桿菌)(Enterotoxigenic?Escherichia?coli，ETEC)K88的快速測定引物。該方法避免了傳統PCR定量鑒定中交叉污染的問題。本發明的方法不僅具有特異性強、重復性好、準確、快速等優點，且沒有假陽性和相互交叉反應的發生，為腸毒性大腸桿菌檢測試劑盒的開發奠定基礎。?

本發明的另一個目的是提供該引物在定性測定和定量測定飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88中的應用。?

【技術方案】?

本發明的目的是通過下述技術方案實現的：?

本發明提供一種飼料樣品中腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic?Escherichia?coli)K88的快速測定引物，其特征在于上游引物為：DCf5’-ACAGGTGAAGGTGGAATGG-3’，也如SEQ?IDNo.1所示，下游引物DCr5’-TTCCTCTTTCCTCTGCGG-3’，也如SEQ?ID?No.2所示。?

本發明的引物可用于定性測定飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88。?

其中，定性測定飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88的測定過程如下：?

A.模板DNA的制備?