[發明專利]飼料樣品中腸毒性大腸桿菌的快速測定引物及其應用

有效

• 申請號: 201110452838.0
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102559892A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉瀅;謝飛;胡婷;劉婷;彭子欣
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;漳州大北農農牧科技有限公司;哈爾濱大北農牧業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種飼料樣品中腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic?Escherichia?coli)K88的快速測定引物，其特征在于上游引物如SEQ?ID?No.1所示，下游引物如SEQ?ID?No.2所示。

2.權1所述的引物在定性測定飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88中的應用。

3.權2所述的應用，其特征在于測定過程如下：

A.模板DNA的制備

(1)取待測樣品：菌液5ml或飼料樣品500-1000mg，在液氮冷凍下迅速研磨成粉末；將粉末放入到2ml離心管中，然后加入1M?Tris.Cl緩沖液750ul，充分混勻；(2)將離心管置于65℃水浴中1-2小時，水浴過程中溫和混勻幾次；取出離心管，每管加入等體積的酚-氯仿溶液600-700ul，混勻后離心，10000rpm，10分鐘；(3)上清液移入新的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后，10000rpm，6分鐘；將上清液移入另一離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置一段時間，然后用槍頭勾出DNA，并用70％乙醇沖洗2次；(4)勾出的DNA，真空干燥后將其溶于500ul?1x?TE中；加入3ul?RNA酶溶液，37℃保溫1小時；(5)加入等體積的苯酚-氯仿溶液，輕輕混勻后，10000rpm離心6分鐘；(6)取上清液，加入等體積的氯仿，輕輕混勻后，10000rpm離心6分鐘；(7)將上清液轉移至DNA吸附柱中，加入1/10體積3M醋酸鈉，混勻后，加入2倍體積預冷的無水乙醇；(8)輕輕混勻靜置5min，10000rpm離心30min；(9)將DNA吸附柱置于新的收集管中，加入70％乙醇，10000rpm離心30min，重復此操作一次；(10)將DNA吸附柱置于新的收集管中，懸空加入100ul的1x?TE溶液，室溫放置10-15min；(11)將DNA吸附柱置于滅菌的1.5ml離心管中，10000rpm離心2min，收集所得溶液，即得到待測樣品DNA模板；在4℃下保存；

B.PCR擴增

反應體系25.0μL：12.5μL?2×PCR-mix、各1μL?10mmol/L權1所述的上、下游引物、1μL50ng/μL?DNA模板、二次蒸餾水補足至25.0μL；

PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃?30s，60℃?45s，72℃?40s，進行35個循環，72℃最終延伸7min，得到的PCR產物，在溫度4℃下保存；

C.結果及判斷

取5μLPCR產物，1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；以目的擴增片段的膠回收產物作為模板為陽性對照，以滅菌水作為模板為陰性對照；根據在327bp處出現預期特征條帶，確定該飼料樣品中含有腸毒性大腸桿菌K88，相反地則不含有腸毒性大腸桿菌K88。

4.權1所述的引物在定量測定飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88中的應用。

5.權4所述的應用，其特征在于測定過程如下：

A.標準及待測樣品模板DNA的制備

B.熒光定量PCR

反應體系25.0μL，包括：2×SuperReal?PreMix母液12.5μL、各20μmol/L?0.5μL權1所述的上、下游引物，DNA模板2.0μL、50×ROX?Reference?Dye?0.5μL、補RNase-free?ddH₂O至25μL體系；

熒光定量PCR反應參數：95℃預變性10min；94℃變性5s，60℃退火15s，40個循環；4℃保存；每個樣品重復3次；

C.外標準品的制備和標準曲線的繪制

外標準品的制備：利用分光光度計將過夜培養的腸毒性大腸桿菌K88發酵液稀釋至1OD，制備模板DNA，濃度為從10⁷個菌的DNA/μL稀釋至1個菌的DNA/μL，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應；

標準曲線的繪制：以不同濃度的模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數為縱坐標，得腸毒性大腸桿菌K88的標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；

D.結果及判斷

以待測樣品DNA和標準品的DNA為模板，用權1所述的引物，以相同的體系同時進行腸毒性大腸桿菌K88的菌毛特異基因的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行飼料樣品中腸毒性大腸桿菌K88的快速定量檢測。