[發(fā)明專(zhuān)利]Figla基因啟動(dòng)子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110449857.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533764A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡玥;華進(jìn)聯(lián);孫軍偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N5/075
• 代理公司: 西安通大專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬(wàn)壽

1.一種Figla基因啟動(dòng)子序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一種基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，其特征在于，在SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因。

3.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，其特征在于，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。

4.一種基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，包含SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列，在Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因EGFP，在EGFP的下游連接抗生素篩選基因neor。

5.如權(quán)利要求4所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體為pFigla-EGFP表達(dá)載體，通過(guò)SalI和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到pEGFP-1表達(dá)載體。

6.Figla基因啟動(dòng)子序列攜帶熒光標(biāo)記基因后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞，以其作為多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成雌性生殖細(xì)胞的篩選標(biāo)記的應(yīng)用。

7.一種多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列，并將Figla基因啟動(dòng)子序列通過(guò)SalI和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到pEGFP-1表達(dá)載體，得到pFigla-EGFP表達(dá)載體；

2)將待轉(zhuǎn)染的多能性干細(xì)胞與pFigla-EGFP表達(dá)載體共同孵育，將pFigla-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到多能性干細(xì)胞之中；

轉(zhuǎn)染48h后傳代，使用包含200μg/mL?G418的培養(yǎng)液篩選G418抗性的克隆，篩選2周后，得到具有G418抗性的多能性干細(xì)胞克??；

3)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的G418抗性的多能性干細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法除去飼養(yǎng)層細(xì)胞，用誘導(dǎo)基礎(chǔ)液重懸多能性干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到不貼壁的皿中培養(yǎng)2～3d，然后將其轉(zhuǎn)入到鋪附有明膠的培養(yǎng)板中，添加0.1μmol/L維甲酸貼壁誘導(dǎo)5～6d；

誘導(dǎo)基礎(chǔ)液為H-DMEM培養(yǎng)基+0.1mmol/L?β-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+15％體積濃度的胎牛血清(FBS)；

誘導(dǎo)5～6d后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選純化出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR進(jìn)行生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)，篩選的GFP陽(yáng)性細(xì)胞即為分化的雌性生殖細(xì)胞。

8.如權(quán)利要求7所述的多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10μg/mL絲裂霉素C處理2h的2～5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65～70％時(shí)融合時(shí)傳代；

培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/L?β-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％體積濃度的FBS。

9.如權(quán)利要求7所述的多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來(lái)源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。