[發明專利]Figla基因啟動子序列及其構建的標記載體和應用

無效

• 申請號: 201110449857.8
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102533764A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 胡玥;華進聯;孫軍偉
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N5/075
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種Figla基因啟動子序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一種基于Figla基因啟動子序列構建的標記基因，其特征在于，在SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動子序列的下游連接熒光標記基因。

3.如權利要求2所述的基于Figla基因啟動子序列構建的標記基因，其特征在于，還在熒光標記基因的下游連接抗生素篩選基因。

4.一種基于Figla基因啟動子序列構建的表達載體，其特征在于，包含SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動子序列，在Figla基因啟動子序列的下游連接熒光標記基因EGFP，在EGFP的下游連接抗生素篩選基因neor。

5.如權利要求4所述的基于Figla基因啟動子序列構建的表達載體，其特征在于，該表達載體為pFigla-EGFP表達載體，通過SalI和BamHI酶切位點將Figla基因啟動子克隆到pEGFP-1表達載體。

6.Figla基因啟動子序列攜帶熒光標記基因后轉染多能性干細胞，以其作為多能性干細胞誘導分化成雌性生殖細胞的篩選標記的應用。

7.一種多能性干細胞向雌性生殖細胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因啟動子序列，并將Figla基因啟動子序列通過SalI和BamHI酶切位點將Figla基因啟動子克隆到pEGFP-1表達載體，得到pFigla-EGFP表達載體；

2)將待轉染的多能性干細胞與pFigla-EGFP表達載體共同孵育，將pFigla-EGFP表達載體轉染到多能性干細胞之中；

轉染48h后傳代，使用包含200μg/mL?G418的培養液篩選G418抗性的克隆，篩選2周后，得到具有G418抗性的多能性干細胞克隆；

3)將處于對數生長期的G418抗性的多能性干細胞用胰蛋白酶消化吹打成單細胞懸液，用差速貼壁法除去飼養層細胞，用誘導基礎液重懸多能性干細胞，轉移到不貼壁的皿中培養2～3d，然后將其轉入到鋪附有明膠的培養板中，添加0.1μmol/L維甲酸貼壁誘導5～6d；

誘導基礎液為H-DMEM培養基+0.1mmol/L?β-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+15％體積濃度的胎牛血清(FBS)；

誘導5～6d后，通過流式細胞儀分選純化出GFP陽性細胞，通過RT-PCR進行生殖特異性基因表達的檢測，篩選的GFP陽性細胞即為分化的雌性生殖細胞。

8.如權利要求7所述的多能性干細胞向雌性生殖細胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的傳代為將多能性干細胞接種到以10μg/mL絲裂霉素C處理2h的2～5代小鼠胎兒成纖維細胞作為飼養層的細胞培養板上，37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養，待克隆增殖到65～70％時融合時傳代；

培養液為H-DMEM培養液+0.1mmol/L?β-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％體積濃度的FBS。

9.如權利要求7所述的多能性干細胞向雌性生殖細胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的多能性干細胞包括胚胎干細胞、誘導型多能性干細胞或成年組織來源的具有胚胎干細胞特性的多能性干細胞。