[發(fā)明專利]Figla基因啟動子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110449857.8
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102533764A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡玥;華進(jìn)聯(lián);孫軍偉
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N5/075
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及動物干細(xì)胞的體外增殖、分化、分離，特別涉及Figla基因啟動子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

干細(xì)胞和生殖細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化的研究是生命科學(xué)研究的重要課題之一。在動物繁殖育種中，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的遺傳完全依賴于生殖細(xì)胞來完成；在人類，由于雌性生殖細(xì)胞——卵子的發(fā)生、成熟障礙等引起的不孕癥更是困擾眾多患者的一個現(xiàn)實(shí)問題；在基礎(chǔ)研究中，卵子更是發(fā)育生物學(xué)研究的最重要研究對象之一；因此雌性生殖的發(fā)生、分化的研究，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的意義。然而高等哺乳動物卵母細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、分化完全在體內(nèi)完成，因此很難動態(tài)實(shí)時地檢測和研究其中的分子事件(Hua?J，Sidhu?KS.Recent?advances?in?the?derivation?of?germ?cells?from?the?embryonic?stem?cells[J].Stem?Cells?and?Development，2008，17：399-411.)。

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞或ESCs)是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或原始生殖細(xì)胞(PGCs)分離而來的多能性干細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞的獨(dú)特生物學(xué)特性，使胚胎干細(xì)胞在細(xì)胞替代治療、組織器官修復(fù)與重建、基因治療以及發(fā)育生物學(xué)模型、新藥開發(fā)和毒理實(shí)驗(yàn)等，幾乎所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域均具有重要的意義。近年來，科學(xué)家從多種來源和采用外源基因轉(zhuǎn)染等方法也獲得了類似胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞。可以將所用具有ES細(xì)胞特性的細(xì)胞通稱為多能性干細(xì)胞。

近年來，Hübner等(Hübner?K，F(xiàn)uhrmann?G，Christenson?LK?et?al.Derivation?of?oocytes?from?mouse?embryonic?stem?cells[J].Science，2003，300：1251-1256.)，Toyooka等(Toyooka?Y，Tsunekawa?N，Akasu?R?et?al.Embryonicstem?cells?can?form?germ?cells?in?vitro[J].Proc?Natl?Acad?Sci?USA，2003，100：11457-11462.)，Geijsen等(Geijsen?N，Horoschak?M，Kim?K?et?al.Derivation?of?embryonic?germ?cells?and?male?gametes?from?embryonic?stem?cells[J].Nature，2004，427：148-154.)分別在《Science》和《Nature》等國際頂尖雜志上報(bào)道在ES細(xì)胞分化為類胚體(EBs)及其進(jìn)一步分化的過程中，存在生殖系細(xì)胞，進(jìn)一步甚至可能分化為卵母細(xì)胞或精子。Lacham-kaplan等(Lacham-Kaplan?O，Chy?H，Trounson?A.Testicular?cell?conditioned?medium?supports?differentiation?of?embryonic?stem?cells?into?ovarian?structures?containing?oocytes[J].Stem?Cells，2006，24：266-273.)用新生鼠睪丸細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞源的EBs，其進(jìn)一步發(fā)育為含有卵母細(xì)胞的卵巢樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)Figlα和ZP3等卵母細(xì)胞特異性標(biāo)志。發(fā)現(xiàn)雄性小鼠ES細(xì)胞在維甲酸(RA)誘導(dǎo)下既可能分化為精子也可能分化為卵母細(xì)胞(Kerkis?A，F(xiàn)onseca?SA，Serafim?RC?et?al.In?vitro?differentiation?of?male?mouse?embryonic?stem?cells?into?both?presumptive?sperm?cells?and?oocytes[J].Cloning?Stem?Cells，2007，9：535-548.)。Chen等(Chen?HF，Kuo?HC，Chien?C-L?et?al.Derivation，characterization?and?differentiation?of?human?embryonic?stem?cells：comparing?serum-containing?versus?serum-free?media?and?evidence?of?germ?cell?differentiation[J].Human?Reproduction，2007，22：567-577.)發(fā)現(xiàn)人類ES細(xì)胞在體外可能自發(fā)分化為卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。Hua等(Hua?J，Sidhu?KS.Coaxing?hESC?to?form?oocyte-like?structures?by?co-culture?with?testicular?extract?and?hormones[J].The?Open?Stem?Cell?Journal，2011，3：34-45.)運(yùn)用睪丸提取物結(jié)合生殖激素誘導(dǎo)人類ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化，可以得到一些具有卵母細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。然而，已有的報(bào)道誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化尤其卵母細(xì)胞分化的數(shù)量有限，重復(fù)性差，其中很重要的原因在于缺少特殊的篩選標(biāo)記。導(dǎo)致誘導(dǎo)過程長，效果不穩(wěn)定，因此很難在體內(nèi)外深入探討相關(guān)細(xì)胞因子、微環(huán)境和一些關(guān)鍵基因在干細(xì)胞向生殖細(xì)胞發(fā)育分化過程中的作用和機(jī)理。