[發(fā)明專(zhuān)利]發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110449716.6
• 申請(qǐng)日: 2011-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102787106A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高聚霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/06
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/06;C12R1/15
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種谷氨酸脫氫酶的發(fā)酵制備方法。

背景技術(shù)

谷氨酸脫氫酶(glutamate?dehydrogenase)是谷氨酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它廣泛分布于細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物組織中，是連接碳、氮代謝的重要酶類(lèi)，催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨，氨基被用于許多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脫氫酶已應(yīng)用到醫(yī)療診斷中，也是制備尿素氮試劑盒(速率法)的必需酶之一。

從1960年開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外對(duì)其他細(xì)菌來(lái)源的谷氨酸脫氫酶已開(kāi)始進(jìn)行分離和研究。但對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌中谷氨酸脫氫酶的報(bào)道較少，谷氨酸棒桿菌中的谷氨酸脫氫酶的提取純化相關(guān)報(bào)道很少，國(guó)內(nèi)尚未實(shí)現(xiàn)菌株發(fā)酵制備谷氨酸脫氫酶的規(guī)模化生產(chǎn)，致使國(guó)內(nèi)研制尿素氮試劑盒所用的谷氨酸脫氫酶大多從國(guó)外進(jìn)口，因此試劑盒的成本較高，為降低其成本必須解決谷氨酸脫氫酶的制備問(wèn)題，因而對(duì)谷氨酸脫氫酶的菌株發(fā)酵制備工藝進(jìn)行深入的研究，將為指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)提供重要的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提出發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的一種工藝，本工藝可以有效提谷氨酸脫氫酶的產(chǎn)量和產(chǎn)品純度，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的一種工藝方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)谷氨酸棒桿菌CQ920的發(fā)酵

谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)36h進(jìn)行活化，活化1～2次；將3-4塊0.5-1.0cm²活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)，32℃，180rpm培養(yǎng)10-12h；培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8％的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，控制發(fā)酵溫度及通風(fēng)，發(fā)酵過(guò)程中流加10％的尿素控制pH值為7.5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開(kāi)始加入50％的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為10h左右。

(2)谷氨酸脫氫酶粗酶液的制備

菌株發(fā)酵液離心，用0.2％的KCl洗滌數(shù)次，取定量濕菌體，按比例加入pH?7.5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4℃用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液。

(3)離子交換層析

谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0.2-0.6mm?NaCl的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)梯度洗脫，分布收集，合并活性部分。

(4)疏水層析

離子交換層析液用PEG6000濃縮后，上樣于用含1m硫酸銨的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的疏水柱HiPrep，用含1m硫酸銨的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)和含50％乙二醇的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分。

(5)凝膠過(guò)濾層析

疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮后上樣于用含0.2m?NaCl的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的凝膠過(guò)濾柱SuperdexG-200，用相同的緩沖液洗脫，分步收集，合并活性高的部分。

(6)超濾

將凝膠過(guò)濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4℃離心5-6h。

(7)成品：取離心后上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品。

本發(fā)明提供的上述以發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特點(diǎn)在于：

(1)誘變篩選獲得高產(chǎn)谷氨酸脫氫酶菌株，菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，發(fā)酵液內(nèi)谷氨酸脫氫酶含量高，酶活性高，為后期發(fā)酵工藝的優(yōu)化及產(chǎn)物的提取奠定了基礎(chǔ)；

(2)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入了稀土元素，有效提高了谷氨酸脫氫酶的活性，優(yōu)化后菌株發(fā)酵酶活達(dá)到110U/mL，為國(guó)內(nèi)已報(bào)道中最高水平；

(3)采用柱層析進(jìn)行谷氨酸脫氫酶的純化，可有效提高終產(chǎn)品的比酶活，同時(shí)降低雜質(zhì)對(duì)產(chǎn)物的影響，有效實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)品的穩(wěn)定性和高效性；

(4)利用液體發(fā)酵制備谷氨酸脫氫酶，與傳統(tǒng)提取法相比，具有周期短、產(chǎn)量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，制備獲得的谷氨酸脫氫酶的比酶活高于260U/mg。

附圖說(shuō)明

附圖1為發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶工藝流程圖，經(jīng)菌株發(fā)酵制備獲得的谷氨酸脫氫酶成品比酶活高于260U/mg。

具體實(shí)施方式

提出以下實(shí)例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。