[發明專利]發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝

無效

• 申請號: 201110449716.6
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102787106A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 高聚霞
• 申請（專利權）人: 西藏金稞集團有限責任公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，包括如下步驟：

(1)發酵：谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養基上，32℃培養36h進行活化，活化1～2次；將3-4塊0.5-1.0cm²活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養基內，32℃，180rpm培養10-12h；培養獲得的種子培養液以8％的接種量轉入滅菌冷卻后的發酵培養基內，控制發酵溫度及通風，發酵過程中流加10％的尿素控制pH值為7.5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50％的葡萄糖溶液，流加糖總時間為10h左右；

(2)粗酶液的制備：菌株發酵液離心，用0.2％的KCl洗滌數次，取定量濕菌體，按比例加入pH?7.5?25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4℃用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液；

(3)離子交換層析：離子交換層析工藝為：谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0.2-0.6mm?NaCl的25mmTris-HCl(pH?7.5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分；

(4)疏水層析：離子交換層析液用PEG?6000濃縮后，上樣于用含1m硫酸銨的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的疏水柱HiPrep，用含1m硫酸銨的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)和含50％乙二醇的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分；

(5)凝膠過濾層析：疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮后上樣于用含0.2m?NaCl的25mm?Tris-HCl(pH?7.5)平衡的凝膠過濾柱Superdex?G-200，用相同的緩沖液洗脫，分步收集，合并活性高的部分；

(6)超濾：將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4℃離心5-6h；

(7)成品：取離心后上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品。

2.根據權利要求1所述的發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，步驟(1)所述的種子培養基：尿素0.5％-0.8％(單獨滅菌)，葡萄糖2％-3％，玉米漿2.5％-3％，硫酸鎂0.4％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鐵2×10^-6，硫酸錳2×10^-6，pH值7.0-7.2；發酵培養基：尿素0.5％-0.8％(單獨滅菌)，葡萄糖2％-3％，玉米漿0.5-％0.8％，硫酸鎂0.4％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鐵2×10^-6，硫酸錳2×10^-6，LaCl₃?0.72mmol/L，CeCl₃?0.071mmol/L，NdCl₃?0.007mmol/L，pH值調節至7.0-7.2。

3.根據權利要求1所述的發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，步驟(1)所述的發酵溫度前期控制為30-35℃，中期為32-37℃，后期為35-38℃；通風控制為前期150-200r/min，中期200-250r/min，后期180-230r/min。

4.根據權利要求1所述的發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，步驟(2)所述的谷氨酸脫氫酶制備過程中菌體洗滌次數為2-3次，濕菌體及緩沖液的比例為1∶5-1∶8(m/v)。

5.根據權利要求1所述的發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，步驟(3)、(4)、(5)、(6)所述的純化各步操作均加入0.02％疊氯化鈉以防止雜菌污染。

6.根據權利要求1所述的發酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝，其特征在于，制備獲得的谷氨酸脫氫酶的比酶活高于260U/mg。